固定化酶法拆分制备L-苯丙氨酸的工艺研究

<正> 苯丙氨酸是人体必需的八种氨基酸之一,在人体内有生理作用的是L-型的,故合成制得D L-苯丙氨酸必须进行拆分。六十年代末,日、美等国用固定化氨基酰化酶拆分制备L-氨基酸已应用于工业生产,由于固定化酶法拆分具有高度专一性,可反复使用,反应条件温和,酶不残留在产物中,产物易纯化、收率较高、无三废等优点,这也引起我国许多科研单     

组成型表达粪产碱杆菌青霉素G酰化酶重组大肠杆菌发酵条件研究

目的:对重组大肠杆菌组成型表达粪产碱杆菌青霉素G酰化酶(AfPGA)进行了发酵条件研究。方法:在摇瓶和5L发酵罐中研究了(NH4)2SO4和葡萄糖浓度对质粒的分离稳定性及青霉素G酰化酶表达的影响。结果:该工程菌质粒具有分离不稳定性,培养基中无(NH4)2SO4时发酵过程中pH和糊精水解生成葡萄糖的浓度变化较小,细胞前期(0h-12h)的生长速率降低,质粒分离稳定性和青霉素G酰化酶的表达水平提高。发酵过程中维持低葡萄糖水平可以限制细胞的生长速率,提高质粒稳定性和促进青霉素G酰化酶的合成。采用混合碳源发酵,发酵培养基含糊精2g/L,12h后以1g/L.h恒速流加葡萄糖至35h,控制流加过程葡萄糖浓度0.1g/L左右,平均比生长速率为0.06h-1,发酵结束时质粒稳定性为86%,青霉素G酰化酶的表达水平达23 000U/L。结论:重组大肠杆菌组成型表达青霉素G酰化酶的研究对工业生产有一定指导意义。     

氨基酸制造工业中的生物催化反应器(续)

<正> 生物催化反应器的应用例虽然很多,但实际应用于工业生产者不到10例,如表3,其中用于氨基酸制造工业的有二、三例,如固定化氨基酰化酶连续拆分DL—氮基酸,固定     

D-氨基酰化酶拆分D,L-苯丙氨酸制备D-苯丙氨酸

进行了以D,L-苯丙氨酸为原料经D-氨基酰化酶制备D-苯丙氨酸的研究。乙酰-D,L-苯丙氨酸浓度为0.5mol.L-1,给酶量为3×104U.L-1时,24 h拆分率可达到97%。采用阳离子交换树脂进行了拆分液中的D-苯丙氨酸的分离,D-苯丙氨酸的收率为95.4%。采用醋酸酐作为催化剂,在145℃的条件下,乙酰-L-苯丙氨酸可以消旋成乙酰-D,L-苯丙氨酸继续拆分。     

青霉素酰化酶基因的克隆与表达I．青霉素酰化酶基因的克隆

用EcoR I—Pst I双酶解的pBR322作为克隆载体,从大肠杆菌D816染色体克隆了青霉素酰化酶基因,这个基陶位于9．1Kb EcoRI片段上。所得克隆株整体细胞酶学特性与大肠杆菌D816一致,酶反应最适温度为55℃,最适pH为7．8—8．0。以青霉素G作为底物时Km为10．3mM,转化产物为6一氨基青霉烷酸。克隆株大肠杆菌c600(pPAl)合成青霉索酰化酶仍需苯乙酸诱导并被葡萄糖阻遏,细胞青霉素酰化酶的活性比大肠杆菌c P1(高2—4倍。     

氨基酸化学与人的年龄

氨基酸的光学异构体在没有酶的作用下缓慢地、自发地发生消旋化反应。因此,经过较长的一段时间后,不论是纯D型还是纯L型异构体都要转化为L型异构体和D型异构体的等摩尔混合物。每一种L型氨基酸在一定温度下都以已知速率发生消旋化反应。这个事实可用来判断人和动物以及骨骼化石的年龄。例如在牙齿的珐琅质里有一种名为牙质的蛋白质,在体温条件下,其L型门冬氨酸以每年百分之零点一的速     

非核糖体肽合成酶基因腺苷酰化结构域序列克隆及分析

微生物许多非核糖体肽类次生代谢产物主要是由非核糖体肽合成酶(NRPS)催化合成。参考Gontang发布的非核糖体肽合成酶(NRPS)通用引物设计扩增NRPS腺苷酰化结构域基因序列的特异引物,从海洋链霉菌L1的基因组DNA中扩增获得一个715 bp的NRPS基因序列。测序结果及比对分析表明该片段属于NRPS腺苷酰化结构域部分序列。对其拟翻译的氨基酸序列组成成分、理化性质进行分析,显示其包含AFD class I超基因家族核心结合区,为NRPS腺苷酰化结构域(A结构域)所在区域。对氨基酸序列的二级结构预测和三级结构模拟,发现与数据库中肠菌素合酶F组分的结构相似。为后续研究A结构域的特异性及完整NRPS基因簇克隆提供了参考。     

甲基苯丙氨酸的合成与拆分

用取代的氯苄衍生物以及乙酰氨基丙二酸二乙酯为原料,合成了邻位、对位、间位甲基取代苯基丙氨酸。以上3种混旋氨基酸在37℃、pH值7.0、底物浓度0.1mol·L-1条件下用氨基酰化酶拆分得到6个光学异构体。本实验中采用的合成工艺适合工业化。     

青霉素酰化酶的研究进展

青霉素酰化酶（penicillin acylase)是合成半合成青霉素的重要酶。近年来,对该酶的结构,分离纯化方法,稳定性,固定化及介质工程等方面进行了大量的研究。本文综述了以上研究的进展。     

细菌中酶蛋白硫辛酰化途径研究进展

硫辛酸为含有两个硫原子的八碳脂肪酸,具有很强的抗氧化性,在保健食品、化妆品和药物等领域都具有良好的应用前景。细胞中硫辛酸是重要的辅因子,影响多种α-酮酸脱氢酶活性,参与能量代谢和物质代谢。模式生物大肠杆菌中酶蛋白硫辛酰化途径研究得较为清楚,包括依赖于LipB-LipA的硫辛酸从头合成途径和依赖于LplA的硫辛酸补救合成途径。但随着研究的深入,发现不同细菌中酶蛋白硫辛酰化途径具有较高的多样性,部分细菌中GcvH蛋白也参与硫辛酰化修饰过程,相关催化酶类也不尽相同。本文系统总结了硫辛酸依赖的多酶复合体、硫辛酰修饰的结构域和GcvH蛋白,以及不同细菌中酶蛋白硫辛酰化途径多样性的研究进展,旨在为进一步了解细菌酶蛋白硫辛酰化机制、开发针对性的抗菌药物以及利用生物法高效生产硫辛酸等方面提供理论支撑。     

固定化巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶酶促合成头孢氨苄的研究

β—内酰胺系列抗菌素抗菌谱广、疗效高、毒副作用小,国际上研究与应用日渐广泛深入。头孢氨苄(Cephalexin)是重要的半合成抗菌素之一,由头孢霉素母核7—氨基脱乙酰氧基头孢烷酸(简称7-ADCA)和侧链结构物苯甘氨酸或其甲酯(PGME)经酰化而生成。酰化有化学法和酶法两种。采用青霉素G酰化酶或a—氨基酸酯酶或,a—氨酰转移酶的酶法,具有工艺操作简单、无需基团保护、环境污染轻等优点。继日本人于70年代初试验成功酶法之后,80年代初我们开展了这方面研究。制备方面,胞外酶优于胞内酶;使用方面,固定化酶优于固定化细胞。在用具有青霉素G酰化酶活性的固定化大肠杆菌(Escherichia coli)细胞合成头孢氨苄的基础上,又研究了用固定化巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)BP931胞外青霉素G酰化酶酰化合成头孢氨苄的条件。本文报道这一研究结果。     

一株产多种β-内酰胺类抗生素酰化酶菌株的筛选

为了从大量的候选菌株中快速筛选头孢菌素酰化酶产生菌,设计并合成了一系列头孢菌素酰化酶的底物类似物。这些酰胺类的底物类似物由二部分组成,一部分为与头孢菌素相同或相似的侧链,另外一部分为发色基团或便于检测的基团。它们被酰化酶水解酰胺键以后可以方便快速的检测,因此用于对大量菌株进行快速筛选。采用这些化合物筛选到6株酰化酶阳性菌株。其中菌株ZH0650能够同时水解GL-7ACA和多个底物类似物。进一步研究表明,该菌至少产生3种酰化酶,AD-NABA酰化酶,青霉素G酰化酶和头孢菌素C酰化酶。我们初步纯化了AD-NABA酰化酶和青霉素G酰化酶,并对头孢菌素C酰化酶的活力进行了鉴定。这是首次报道的可以产生青霉素G酰化酶和头孢菌素酰化酶等多种酰化酶的菌株,具有良好的应用前景。     

M.natoriense TNJL143-2菌的D-氨基酰化酶的固定化研究

D-氨基酰化酶可用于D-氨基酸的生产,本研究利用来源于Microbacterium natoriense TNJL143-2的D-氨基酰化酶,分别通过琼脂糖包埋、介孔二氧化硅MCM-41和SBA-15吸附,制备了三种固定化酶,并对三种固定化酶的固定化条件、酶学性质、活性保持时间、重复使用次数、米氏常数等参数进行了研究。结果表明,MCM-41载体固定化酶的蛋白固定率为91.6%,SBA-15载体固定化酶的蛋白固定率为88.0%,琼脂糖包埋法蛋白固定率为79.5%。MCM-41、SBA-15以及琼脂糖三种载体固定化酶最适反应pH均为7.0,最适反应温度范围均为37℃。在固定化酶的活性保持时间以及重复利用活性方面,SBA-15固定化酶同样优于其他两种固定化酶。以D型苯丙氨酸(D-Phe)为底物时,琼脂糖包埋固定化酶的Km为28.8 mol/L,SBA-15固定化酶的Km为25.9 mol/L,MCM-41固定化酶的Km为25.0 mol/L。同时本文还探索了三种固定化酶的pH使用范围及酸碱稳定性、温度使用范围及热稳定性,结果显示,SBA-15作为固定化载体均表现出较广的适用范围及较高的稳定性。在不同条件的反应体系中,SBA-15固定化酶的蛋白损失率始终小于其他两种固定化酶。     

生物催化氨基酸C—N裂解反应的研究进展

氨基酸脱氨酶能催化系列氨基酸C—N裂解反应生成对应的α 酮酸和氨,是代谢途径及生物催化的重要酶.综述了近年来催化氨基酸C—N裂解反应的5'磷酸吡哆醛介导的苏氨酸脱氨酶、黄素腺嘌呤二核苷酸介导的L氨基酸脱氨酶和L氨基酸氧化酶,以及这些关键酶应用于多酶级联反应中以生产α 羟基酸、α 酮酸、D氨基酸等精细化学品的研究进展.此...     

头孢菌素酰化酶

7-氨基头孢烷酸(7-amino cephalosporanic acid, 7-ACA)是医药工业合成大多数头孢菌素的重要原料.头孢菌素酰化酶(cephalosporin acylase, CA)催化头孢菌素C(CPC)和戊二酰-7-氨基头孢烷酸(GL-7ACA)的水解反应, 生成7-ACA.根据CA催化底物的不同, 可将其划分为两类：CPC酰化酶和GL-7ACA酰化酶.由CA的同源性、分子质量大小和基因结构, 可以把头孢菌素酰化酶划分为五种;讨论了酶的基本性质.通过CA与N端亲核水解酶(Ntn水解酶)的比较, 推测CA属于Ntn水解酶, 并由此可以进一步理解它们的生理功能.     

基因工程菌1016氨基酰化酶的酶学性质研究

研究了基因工程菌 1 0 1 6所产的氨基酰化酶的酶学特性。该酶的拆分速率符合米氏方程 ,且在 0 .5mol/L的高底物浓度下 ,无底物抑制现象。 37℃时的米氏常数和最大反应速率分别为 0 .0 4 8mmol/L和 2 .1 78mmol/L·h。最适反应温度为 5 5℃。5 5℃时 ,Km为 0 .0 37mmol/L ,Vmax为 2 .5 5 8mmol/L·h。最适底物为乙酰蛋氨酸 ;热稳定性好。     

渗透压冲击法快速高效提取青霉素酰化酶

青霉素在临床上的大量使用造成了细菌的耐药性增强,青霉素本身又具有不宜口服、过敏性强等缺点,人们正致力于研究有诸多优良特性的半合成青霉素。大肠杆菌青霉素酰化酶用于裂解青霉素生产6-氨基青霉烷酸(即6-ＡＰＡ,半合成青霉素的重要中间体),该酶的提取、纯化和固定化研究在半合成青霉素工业有重要的意义[1]。大肠杆菌青霉素酰化酶属胞内酶,文献报道多采用超声波法提取,该法得到的粗酶液比活低,一般要经过四、五步纯化才能得到较高比活[2,3,4]的酶液。采用渗透压冲击法提取青霉素酰化酶,得到的粗酶液比活高,只需经过硫酸铵沉淀一步纯化就…     

青霉素酰化酶操纵子为负调控模型

质粒pBR322用HindⅢ—BarnH Ⅰ双酶切作为载体,从质粒pPAd上克隆含有pac操纵基因的HindⅢ一。BglⅡl．65kb的DNA片段,得到质粒pPA41。质粒pBR322和pPA41转化染色体上含有完整pac操纵子的大肠杆菌D816,进行操纵基因滴定。大肠杆菌D816、D816(pPA4l)．D816(pBR322)在22℃摇瓶发酵96h,NIPAB法测定青霉素酰化酶活性。结果发现,在不加诱导剂时,D816(pPA41)产生的青霉素酰化酶是D816细胞的2．5倍,在加诱导剂时,D816(pPA41)产生的青霉素酰化酶是D816细胞的1．3倍。对照组D816(pBR322)细胞产生的青霉素酰化酶和：D816细胞产生的几乎一致,说明质粒pPA41的竞争滴定作用确是其上克隆的操纵基因引起的。高拷贝的操纵基因(pPA41)和pac操纵子竞争结合调节蛋白,使得pac操纵子表达增加,说明调节蛋白在pac操纵子表达过程中起阻遏作用,调节蛋白为阻遏蛋白,pac操纵子为负调控模型。R．NA—DNA点杂交检测pac基因表达,发现D816(pPA41)细胞转录产生的pac—mRNA量明显高于D816细胞,mRNA量和青霉素酰化酶活性呈现一致的趋势,证实了pac操纵子的负调控发生在转录水平。     

一株产多种β-内酰胺类抗生素酰化酶菌株的筛选

为了从大量的候选菌株中快速筛选头孢菌素酰化酶产生菌,设计并合成了一系列头孢菌素酰化酶的底物类似物。这些酰胺类的底物类似物由二部分组成,一部分为与头孢菌素相同或相似的侧链,另外一部分为发色基团或便于检测的基团。它们被酰化酶水解酰胺键以后可以方便快速的检测,因此用于对大量菌株进行快速筛选。采用这些化合物筛选到6株酰化酶阳性菌株。其中菌株ZH0650能够同时水解GL7ACA和多个底物类似物。进一步研究表明,该菌至少产生3种酰化酶,ADNABA酰化酶,青霉素G酰化酶和头孢菌素C酰化酶。我们初步纯化了ADNABA酰化酶和青霉素G酰化酶,并对头孢菌素C酰化酶的活力进行了鉴定。这是首次报道的可以产生青霉素G酰化酶和头孢菌素酰化酶等多种酰化酶的菌株,具有良好的应用前景。     

为什么地球上的生物使用左旋氨基酸和右旋糖分子

地球生物体内的蛋白质都由左旋(L)型的氨基酸构成,RNA则含有右旋(D)型核糖,生物的主要能源分子葡萄糖也是右旋的。理论上,氨基酸和糖类分子的非酶合成可同时形成数量相同的右旋化合物和左旋化合物。但由于太空中偏振紫外线的存在及陨石表面的性质,使左旋氨基酸的数量多于右旋氨基酸,地球的环境条件又将这种差别进一步放大。左旋氨基酸更容易与右旋糖分子相互作用,这样相互选择和配合,最终形成了生物只使用一种旋光异构体的现象。