眼镜王蛇泛素融合蛋白基因和核糖体蛋白L30基因的克隆及分析

从广西产眼镜王蛇（Ophiophagus hannah）毒腺中抽提总RNA,经mRNA纯化后构建眼镜王蛇毒腺cDNA文库。从所构建的cDNA文库中,随机筛选200个克隆测序,得到两个在进化上高度保守的基因：泛素融合蛋白基因（GenBank登录号为AF297036）和核糖体蛋白L30基因（GenBank登录号是AF297033）。前者cDNA的开放阅读框为387bp,后者为348bp。前者编码128个氨基酸残基组成的泛素融合蛋白前体;后者编码115个氨基酸残基组成的核糖体蛋白L30前体。由cDNA序列推导出的氨基酸序列分析表明,泛素融合蛋白前体包括N-末端的泛素结构域（76个氨基酸残基）和C-末端的核糖体蛋白L40结构域（52个氨基酸残基）。该蛋白为一高碱性蛋白,C末端含有一个“锌指”模式结构。与16个物种比较的结果表明,眼镜王蛇与脊椎动物的泛素融合蛋白氨基酸序列相似度较高,具有高度的保守性。     

用定点诱变技术鉴定蛇毒解联蛋白RGD侧翼氨基酸残基的结构和功能

为了证实蛇毒蛋白RGD侧翼氨基酸残基对ADP诱导的血小板凝聚抑制作用的重要性,分析了RGD环上游氨基酸残基对解联蛋白活性的影响。将位于两种角联蛋白蝮蛇毒素（kistrin）和华丽蛇毒素(elegantin）之间的氨基酸残基和RGD环内的氨基酸残基进行杂交。用定点诱变技术奖elegantin一级结构骨的KKKR^44T^45I^46／A^50RGDN^54P^55分别突变为SKAG^44T^45I^46/P^50RGDM^54P^55和 SKAG^44I^46/P^50RGDM^54P^55,这些序列和kistrin中相应的序列S^39RAGT^43/A^50RGDN^54P^55有相似之处,序列由KKKR^44T^45I^46/A^50RGDN^54P^55突变为SKAG^44T^45I^46/P^50RGDM^54P^55,显著地降低了elegantin对血小 板凝聚的抑制因子的活性,而T^45的缺人（KKKR^44T^45I^46/A^50RGDN^54P^55突变为SKAG^44T^45I^46/P^50RGDM^54P^55）支增强了elegantin对血小板凝聚的抑制作用,进一步研究证明它们的电泳特性是不同的。表明降RGD模体上游39－45倍的氨基酸与RGD侧翼氨基酸残基序列对解联蛋白的结构和功能具有重要作用。     

梨小食心虫化学感受蛋白cDNA的克隆、序列分析及原核表达

为了研究梨小食心虫Grapholita molesta化学感受蛋白（chemosensory proteins, CSPs）在化学感受系统中的作用, 本研究利用RT-PCR和RACE技术克隆到一条梨小食心虫化学感受蛋白的全长cDNA序列, 命名为GmolCSP （GenBank 登录号： JQ821389）。序列分析表明, GmolCSP开放阅读框序列为384 bp, 编码127个氨基酸残基, 预测N末端含有18个氨基酸组成的信号肽序列, 其成熟蛋白的预测分子量为12.80 kD, 等电点为8.33。该基因编码的氨基酸序列与其他鳞翅目昆虫化学感受蛋白的氨基酸序列具有较高同源性。RT-PCR结果显示, GmolCSP在梨小食心虫成虫触角、 去触角的头、 胸、 腹、 足和翅中都有表达。将GmolCSP重组到表达载体pET-32a中, 转入大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）进行表达。SDS-PAGE和Western 印迹检测结果显示, 梨小食心虫化学感受蛋白基因在大肠杆菌中成功地表达出一个分子量约为29 kD的融合蛋白, 与预测的融合蛋白分子量大小一致。本研究结果为进一步研究该蛋白的分子结构和功能奠定了良好基础。     

家蝇金属硫蛋白基因的克隆、原核表达及活性检测

金属硫蛋白是一类普遍存在于生物体内、富含半胱氨酸的小分子蛋白,能螯合多种金属离子。本研究根据EST序列信息,利用RACE技术克隆到1条家蝇Musca domestica金属硫蛋白基因MdMtn（GenBank登录号为GU289398）。序列分析表明,MdMtn cDNA全长408 bp,包含1个123 bp的开放阅读框,编码40个氨基酸残基,其中半胱氨酸残基10个,呈-C-X-C-方式排列。此蛋白理论分子量为3.8 kD,等电点为878。为了解家蝇金属硫蛋白对重金属的结合活性,构建了pET-DsbA-MT表达载体,并转化Escherichia coli BL21（DE3）宿主菌进行融合表达。研究发现MT重组菌对重金属镉的耐受性得到了明显加强,提示MdMtn基因可能在家蝇适应重金属环境中起到积极作用。     

我国四株狂犬病毒M和P基因序列分析和所编码蛋白的分析

为了解我国狂犬病毒M、P基因序列和结构特点,用RT-PCR方法获得目的基因片段,测定核苷酸序列后,计算机分析核苷酸和氨基酸序列及其功能区位点结构。结果显示四株病毒M基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为83.9%～99.5%和93.1%～99%,四株狂犬病毒M蛋白上调节病毒RNA转录和复制功能的第58位氨基酸残基均为谷氨酰胺残基(E),与特异性细胞蛋白WW区域作用的PPxY结构序列均为PPEY保守序列;四株病毒P基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为83.6%～99.8%和87.2%～99%,P蛋白与胞浆动力蛋白轻链LC8相互作用的序列位于143～148位氨基酸残基,均为DKSTQT,四株病毒P基因与L蛋白、N蛋白作用位点序列显示未发生影响其生物学功能的变异。研究结果证实了这两种蛋白结构在病毒致病性中起重要作用的推论。     

甘薯贮藏蛋白(sporam in)A基因编码区克隆及序列同源性分析

采用 PCR技术 ,从我国广泛栽培甘薯品种南薯 88基因组中扩增和克隆到甘薯贮藏蛋白 A基因编码区段 ,并测定了其全部核苷酸序列 .该编码区长 65 7bp,编码一个长 2 1 9个氨基酸残基的蛋白质 ,其中信号肽长 37个氨基酸残基 ,成熟蛋白质长 1 82个氨基酸残基 ,其分子量为 2 0 k D.将该片段的核苷酸序列与已登录在 Gen Bank中的另外 6个甘薯贮藏蛋白 A基因编码区序列进行比较 ,发现其同源性高达 90 % ,说明甘薯贮藏蛋白 A基因编码区序列具有高度保守性 .虽然 7个基因编码区的核苷酸总变异为 1 0 % ,但在每两个基因之间的比较则表明其核苷酸的变异范围小于 7% .     

小菜蛾化学感受蛋白基因PxylCSP1的克隆和表达

利用RT-PCR和RACE技术克隆到小菜蛾Plutella xylostella 化学感受蛋白（CSP）基因PxylCSP1（GenBank登录号: FJ361903）,其核苷酸序列全长405 bp,编码134个氨基酸残基,预测N-末端包含19个氨基酸组成的信号肽序列,估测其成熟蛋白分子量为13.56 kD,等电点为6.12。该基因编码氨基酸序列和其他鳞翅目昆虫CSP的氨基酸序列比对同源性较高（70%~80%）。RT-PCR结果表明PxylCSP1不仅存在于小菜蛾的触角中,还存在于头、足、腹和翅中。Real-time PCR结果表明PxylCSP1的表达水平因被测小菜蛾的性别、日龄、组织不同和交配与否而异。     

细菌AcrAB-TolC型外排泵中AcrA蛋白的进化分析

研究不同耐药细菌AcrAB-Tolc型外排泵中关键蛋白AcrA的序列,针对其保守及非保守氨基酸残基进行该类蛋白的进化分析,构建蛋白进化树。收集来源于不同细菌的已知序列的AcrA蛋白,去除冗余并进行序列比对之后,根据其序列比对结果的相似性、氨基酸残基的保守性研究其进化特征。结果表明,不同细菌的AcrA蛋白部分氨基酸残基具有高度的保守性,这与其实现生物学功能有关,非保守区域是主要的进化区域。可为不同菌株的进化提供参考,同时为以AcrAB-Tolc型外排泵为靶标的新药研究提供相关数据。     

斜纹夜核多角体病毒DNA XbaⅠ4.0kb片段锌指蛋白基因及重复序列分析

测定了斜纹夜核多角体病毒（Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus,SpltNPV)中山大学分离株基因DNA XbaI4.0片段全序列,该片段包括一个锌指蛋白基因及三个区域的DNA重复序列（SR1、SR2、SR3）。该锌指蛋白基因读码框为2196个核苷酸,编码731个氨基的蛋白质,分子量为83．09KD,该蛋白的等电点为4．61,在其5‘非编码区内有一个杆状病毒早期启动子基序GAGT5及一个TATA盒,在其终止密码的下游有5个真核生物转录mRNA时poly(A)加尾信号AATAAA。在223－241氨基酸残基之间有一个锌指蛋白基序,这一基序属于锌指蛋白基序中的C3HC4类,即环指（Ring finger)类基序,在323－340氨基酸残基区域为一个核定位信号,该蛋白可能为一个高度折叠的蛋白质。在该片段中存在三个DNA重复序列区域（SAR1、SR2、SR3）,其中SR1与SR3区或存在更大量的重复序列,SR1区域其中的一个重复序列长达41bp,SR1,SR3重复序列区域可能作为该病毒转录的增强子,或者作为DNA复制的起始点。     

脆性组氨酸三联体与复制蛋白A相互作用关键氨基酸残基的鉴定

目的：研究脆性组氨酸三联体（Fhit）对ATR/CHK1通路的影响,在确定Fhit与复制蛋白A（RPA）存在相互作用的基础上鉴定Fhit与RPA相互作用的关键氨基酸残基,为进一步研究Fhit特异的信号通路奠定基础。方法：构建一系列Fhit缺失突变体基因Fhit1～Fhit11及6种Fhit点突变体基因,将这些基因插入含GST基因的原核表达载体中,在大肠杆菌中表达并纯化GST-Fhit1～GST-Fhit11融合蛋白、突变体GST-FhitSIYEEL、GST-FhitIY、GST-FhitEL、GST-FhitF、GST-FhitA,以及GST-FhitD融合蛋白,用GST沉降技术研究Fhit与RPA相互作用的关键氨基酸残基。结果：Fhit蛋白第112～117（SIYEEL）残基可能是Fhit与RPA相互作用的关键区域,而第114（Y）残基可能是Fhit与RPA相互作用的关键氨基酸残基。结论：确定了Fhit与RPA相互作用的关键氨基酸残基,为阐明Fhit在维持基因组完整性方面的机理提供了线索。     

苹果金属硫蛋白基因MdFjMT2克隆及生物信息学分析

以红富士苹果（Malus domestica CV Red Fuji）浓红型芽变和其条红母株为试材,构建抑制性差减杂交（Suppression Subtractive Hybridization,SSH）文库,差异筛选SSH-cDNA文库,经过大量测序构建成红富士苹果ESTs序列本地数据库,对本地数据库进行Blastn检索,得到42条金属硫蛋白基因MdFjMT2 cDNA片段,通过序列拼接和?逆转录PCR（RT-PCR）方法,获得了红富士苹果金属硫蛋白基因MdFjMT2全长cDNA序列（Genbank登录号为HQ730757）,该基因全长684 bp,其中5′ 非翻译区97 bp,3′ 非翻译区347 bp,开放阅读框（ORF）为240 bp,编码79个氨基酸,推测蛋白分子量为7.7938 kDa,理论等电点为4.75。该基因具有金属硫蛋白基因的典型结构域特征,编码的氨基酸序列中含有14个半胱氨酸残基Cys（C）,Cys 残基的排列特征是以CC、CXC和CXXC集中分布在肽链的N端和C端。系统进化分析表明MdFjMT2与砂梨（Pyrus pyrifolia）、苹果（Malus domestica）和小金海棠（M. xiaojinensis）等植物金属硫蛋白保持了较近的亲缘关系,与扁桃（Prunus dulcis）、旱柳（Salix matsudana）、美味猕猴桃（Actinidia deliciosa）等植物的亲缘关系较远。生物信息学分析结果表明,MdFjMT2主要位于叶绿体中,没有信号肽,是非跨膜亲水性蛋白,其蛋白质二级结构的主要元件是无规则卷曲,没有功能结构域。这些结果为MdFjMT2的结构与功能挖掘提供一定的参考。本研究结果有助于研究该基因在苹果着色中的作用,阐明苹果着色的分子机制。     

龙须菜及其色素突变体藻胆蛋白的光谱及分子特征的比较

对龙须菜（Gracilaria lemaneiformis Greville）及其色素突变体藻胆蛋白吸收光谱进行了比较研究,结果显示不同藻株藻红蛋白的吸收光谱有显的变化,而藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的基本相同。我们克隆了龙须菜及其色素突变体的藻红蛋白亚基的部分基因序列,用该基因序列推导出的氨基酸序列进行分析以揭示这一变化的分子机理,结果显示除几个氨基酸残基的替换外,几株藻间的藻红蛋白的氨基酸序列十分相似,一些氨基酸的替换发生在决定藻红蛋白二级结构及亚基间相互作用的区域,可能会影响藻胆蛋白的构型及相互作用,导致光谱性质的变化。     

Ⅱ型葡萄糖异构酶N端随机卷曲序列的嫁接效应

木糖/葡萄糖异构酶（xylose/glucose isomerase, XIase/GIase）是果葡糖浆生产的关键用酶,也是重要的模式酶,其组成域的结构和功能一直是研究的热点。本研究采用重叠PCR技术将源自超嗜热菌Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus的Ⅱ型葡萄糖异构酶（TTGIase）N端31个氨基酸序列融合到嗜热菌Thermobifida fusca的I型葡萄糖异构酶（TFGIase）的N端,构建了融合蛋白N-TFGIase。发酵实验结果显示,在相同培养和诱导条件下,N-TFGIase菌体单位浓度产酶量比TFGIase高出约40%;酶学检测结果显示,N-TFGIase比酶活较TFGIase高出26%,最适温度较TFGIase高出5℃,75℃下的半衰期较TFGIase延长30%,最适pH较TFGIase降低1.0。序列分析表明,TTGIase N端序列的mRNA二级结构不形成有阻碍的颈环结构,提高了融合蛋白的表达效率;其含有的31个氨基酸残基的疏水性指数均小于0,利于融合蛋白的初始折叠和包装;其含有的酸性氨基酸残基比例约为碱性氨基酸残基比例的两倍,减小了酸性介质环境对融合蛋白分子表面的影响。实验结果提示,将来自超嗜热菌的Ⅱ型XIase/GIase的N端随机卷曲序列融合到I型XIase/GIase N端,能够提高后者的热稳定性、酸稳定性和表达效率等酶学性质,与我们的预测结果相一致,这为酶的分子改造和生产应用提供了参考。     

中国柿果实扩展蛋白基因的cDNA克隆与序列分析

以中国柿膨大期和成熟衰老期果实cDNA为模板。参照其它植物细胞壁扩展蛋白（expansin）基因序列设计兼并引物。进行RT-PCR。得到的扩增产物与pUCm—T质粒连接。转化大肠杆菌JMl09。任意挑选阳性克隆。进行序列测定。得到2个序列不同的expansin cDNA片段。分别命名为Cdk—Exp1和Cdk—Exp2。2个片段均存在expansin基因的保守区域。即8个半胱氨酸残基和3个色氨酸残基。Cdk—Expl和Cdk—Exp2分别由531个碱基和522个碱基组成。编码177个和174个氨基酸,二者核苷酸与氨基酸序列同源性分别高达92．635％和92．156％。中国柿果实expansin cDNA与草莓、番茄和桃果实的扩展蛋白基因在氨基酸水平上有较高的同源性。     

拟斯卑尔脱山羊草基因的克隆与表达研究

Avenin—like基因是近年来发现的一类新基因。根据小麦avenin-like基因的保守序列,设计合成了一对特异性引物,对拟斯卑尔脱山羊草（Aegilops spehoides,ss）的基因组DNA进行avenin-like基因扩增、克隆、序列测定和表达分析,发现了一个新型avenin—like基因。基因长855bp,编码284个氨基酸残基,分子量约为33kD。Souchern blot结果表明其属于多基因家族。RT—PCR证实了avenin-like基因在籽粒胚乳中特异性表达。其对应的氨基酸序列含有18个半胱氨酸残基,可以形成7对分子内二硫键。研究表明Avenin-like蛋白是一类新型的储藏蛋白。这为小麦加工品质的改良提供了理论依据和遗传资源。     

繁缕核糖体失活蛋白基因克隆及序列分析

采用同源克隆结合RACE法,克隆了繁缕核糖体失活蛋白的全长cDNA,命名为q3(GenBank accession GQ870262)。序列分析结果表明,q3的开放阅读框(ORF)长780 bp,编码259个氨基酸。序列G+C含量为41.5%,与大部分Ⅰ型RIP基因相近。q3编码的蛋白质命名为Q3,理论分子量为28.16 kD,pI为9.44,均与Ⅰ型核糖体失活蛋白相近;包含由23个氨基酸组成的信号肽。功能结构域分析发现,该蛋白含有3个蛋白激酶磷酸化位点、4个络氨酸蛋白激酶磷酸化位点和7个N-肉豆蔻酰化位点。三级结构预测发现,有35.52%的氨基酸残基参与了α螺旋,24.32%的氨基酸残基组成延伸链,40.15%的氨基酸残基随机缠绕其中。基于繁缕及其近缘种核糖体失活蛋白的氨基酸序列构建的系统发育树显示,其结构与经典分类结果基本一致。     

西方蜜蜂表皮蛋白基因apd-like转录起始位点的定位及cDNA序列的分析

Apidermin蛋白家族是根据蜜蜂表皮蛋白apidermin 1-3（APD 1-3）而命名的一个新型的昆虫结构性表皮蛋白家族。为了鉴定西方蜜蜂Apis mellifera基因组序列上毗邻基因簇apd 1-3的一个预测基因座LOC727145是否为一个新的apd基因,本研究在用5′LongSAGE标签定位该基因的转录起始位点（TSS）的基础上,利用其中的3条5′LongSAGE标签序列作为上游引物,通过RT-PCR方法克隆了该基因的cDNA序列（GenBank登录号： GU358197, GU358199, GU358198）。生物信息学分析发现,基因座LOC727145含有2个外显子和1个“GT-AG”型内含子,其cDNA序列富含GC（70％）,可编码一条长152 aa残基的高度疏水性多肽。此多肽序列的氨基酸组成与蜜蜂APD 1-3表皮蛋白类似, 富含Ala, Gly, Pro, Leu 和Val 5种氨基酸（占77％）, 其中Ala残基含量最高（29％）。该多肽序列与蜜蜂APD-1表皮蛋白序列的相似性为50％, 且其N末端的预测信号肽序列与APD 蛋白的信号肽序列类似。5′LongSAGE标签的基因组定位结果显示,基因座LOC727145在雄蜂头部中表达丰度很高,RNA PolⅡ可从6个不同的TSS上以不同效率起始转录,其中由一个优势TSS上起始了90％的转录。本研究为apidermin表皮蛋白家族增添了一个新成员, 命名为apidermin-like (apd-like)。     

小菊锌指蛋白基因cDNA全长克隆及表达分析

目的：克隆菊花耐盐碱相关锌指蛋白基因,并进行盐胁迫和品种间差异的表达分析。方法：从大量菊花资源中筛选出抗盐碱品系小菊‘阳光’,利用RT—PCR从经150mmol／L碳酸钠处理的小菊‘阳光’叶片中分离得到一个锌指蛋白cDNA全长克隆,用Northern杂交检测其在不同盐处理和不同品种小菊中的表达。结果：获得了全长794bp的基因CmSTZF（GenBank接受号为DQ864730）,编码区为170个氨基酸残基。Blast分析表明,CmSTZF含有AN1型锌指结构,序列模式为C-X2-C—X（9—12）-C-X（1-2）-C-X4-C-X2-H-X5-H-X-C,由Cys^110-Cys^113-Cys^131-His^134及Cys^124-Cys^126-Cys^142-His^140分别围绕锌离子与其他氨基酸共同组成2个锌指四面体结构;在第67～76及第94～104氨基酸残基序列间存在核定位信号。同源性比较发现,CmSTZF与水稻OsISAPI具有54％的同源性,而二者的锌指保守区相似性达100％。Cluster分析表明,小菊CmSTZF锌指蛋白与水稻的2种逆境反应蛋白亲缘关系最近,归属同一类逆境功能蛋白。在150mmol／L碳酸钠胁迫下,耐盐小菊‘阳光’锌指蛋白表达量明显高于非耐盐小菊‘神韵’,表明CmSTZF锌指蛋白基因在盐碱胁迫下起重要的调控作用。结论：克隆了小菊耐盐碱相关的锌指蛋白基因CmSTZF,其在耐盐小菊‘阳光’中的表达量高于非耐盐小菊‘神韵’,这为小菊锌指蛋白基因CmSTZF耐盐碱功能分析奠定了基础。     

Tat蛋白及其内化作用

人类免疫缺陷病毒 1型的复制受反式激活蛋白 (ｔｒａｎｓ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ ,Ｔａｔ)的调节。Ｔａｔ蛋白是一个小型蛋白 ,其分子大小依ＨＩＶ 1病毒的品系不同而有所差异 ,从 86到1 30个氨基酸残基不等[1] ,它由两个外显子编码。就 1 0 1个氨基酸的Ｔａｔ蛋白而言[2 ] ,第一个外显子编码 1～ 72氨基酸 ,第二个外显子编码 73～ 1 0 1氨基酸。在细胞内 ,Ｔａｔ蛋白对病毒基因的转录有重要作用。ＨＩＶ 1病毒的ｍＲＮＡ 5′端有一段序列叫做反式激活反应区域 (ｔｒａｎｓ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｒｅｇｉ…     

一新中温碱性蛋白酶基因的克隆及原核表达

摘要:【目的】从环境中分离筛选产蛋白酶、降解蛋白质的菌株,寻找使用价值较高的碱性蛋白酶。【方法】通过酪蛋白平板法分离筛选产蛋白酶菌株,经生理生化方法及16S rDNA 基因序列鉴定菌株;利用简并引物及基因组步移克隆蛋白酶完整开放阅读框;蛋白酶前体蛋白及成熟肽序列在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中进行重组表达;纯化活性蛋白酶后,利用化学合成多肽底物(succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide)检测酶活性质及其催化活力。【结果】分离到的菌株L010被鉴定命名为芽胞杆菌( Bacillus sp.)L010;蛋白酶开放阅读框包含了1149个碱基,编码382个氨基酸,氨基酸序列按其功能分为N端的30个氨基酸残基组成的信号肽,77个氨基酸残基构成的前导肽,C端275个氨基酸残基组成的成熟肽;此蛋白属于丝氨酸蛋白酶家族中枯草杆菌蛋白酶类(Subtilisins)成员,并命名为SprD;SprD的前体蛋白在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中重组表达时,在前导肽辅助下自加工为活性蛋白酶;SprD呈现出较高的催化活力,其反应最适条件为温度70℃,pH9－10。【结论】SprD在碱性(pH 7.0－ 10.0)、中高温(25℃－60℃)条件下的稳定性及较高的催化能力使其具有一定的研究和潜在利用价值。