转化生长因子α－绿脓杆菌外毒素融合蛋白TGFα－PE40高效表达质粒的构建和表达

利用基因工程技术,将质粒pYX382用xbaI和EcoRl切下插入的TGFa—PE40融合 基因片段-连接到可表达载体pCB604的XbaⅠ／EcoR Ⅰ位点中,构建成新的重组质粒p2x—TP1。P2x—TP1转化E.coli BL2l感受志菌后,在ⅠPTG诱导下Ⅰpp启动子转录表达TGFα—PE40融合蛋白。表达产物主要以包涵体形式沉积在细胞内。融合蛋白表达量的高低与诱导时的细胞密度,诱导的温度以及培养基有关。在一定范围内与诱导剂的剂量以及诱导时间的长短无关。P2x—TPl重组质粒在工程菌中的表达TGFα－PE40融合蛋白量约为50mg／L。     

IL-1018-57-PE40高效表达、纯化及细胞活性之研究

以IL-10的功能短肽(40肽,即IL-10第18号至57号氨基酸)为导向部分与PE40(绿脓杆菌外毒素除去受体结合区后的剩余部分)融合分别构建了IL-101857PE40的胞质和胞周质表达质粒,其中,IL101857PE40在Rosettablue(DE3)中以高效胞质可溶形式表达,在BL21(DE3)pLysS中以胞周质分泌形式表达;表达宿主菌Rosettablue(DE3)超声波破碎后,依次通过硫酸铵盐析、疏水层析、铜离子亲和层析、阴离子交换层析纯化后,得96%重组毒素纯品;细胞活性实验、细胞ELISA和荧光标记实验表明,构建的IL101857PE40符合免疫毒素的作用机理。因此,该实验为PE免疫毒素的规模制备和纯化做了一定的有益的探索。     

TGFα对肝癌细胞SMMC-7721增殖和ERK蛋白的影响

目的观察TGFα诱导肝癌细胞增殖和对信号传导因子ERK蛋白表达的影响.方法应用MTT比色法观察不同浓度TGFα对肝癌细胞SMMC-7721的增殖作用.用流式细胞术检测TGFα对肝癌细胞凋亡和细胞周期的影响.用免疫组化方法检测TGFα对ERK蛋白表达影响.结果 1μg/L TGFα作用24h SMMC-7721细胞增殖率为3%(P>0.05);作用48h后增殖率达16%(P<0.05).5μg/L TGFα作用24h增殖率达18%(P<0.05);作用48h增殖率达24%(P<0.01),增殖效应呈时间、剂量依赖性.5μg/L TGFα作用肝癌细胞48h能抑制肝癌细胞凋亡,使细胞滞留于G2M期,增加PI.5μg/L TGFα能促进ERK蛋白在细胞核中的表达.结论 TGFα能促进肝癌细胞增殖,增加ERK蛋白在细胞核中的表达.     

IL-1023-57-PE40可溶表达、纯化及其细胞活性

以IL-10的功能短肽(35肽,即IL10第23至57氨基酸残基)为导向部分与PE40(绿脓杆菌外毒素除去受体结合区后的剩余部分)融合分别置入pet20b( )和pet28a( )构建重组毒素IL102357PE40的两种表达质粒,其中置于pet20b( )的重组毒素在BL21(DE3)pLysS中以周质分泌可溶形式表达,置于pet28a( )的重组毒素在Rosettablue(DE3)中以高效胞质可溶形式表达;依次通过硫酸铵盐析、疏水层析、阴离子交换层析、铜离子亲和层析纯化周质分泌成份,得90%重组毒素纯品;细胞活性实验表明,该重组毒素只对单核巨噬细胞有杀伤作用;细胞ELISA显示,该重组毒素对单核巨噬细胞的杀伤作用(IC50为13.9pmolL)符合绿脓杆菌外毒素的作用机理.     

IL-1023-57-PE40分泌表达的初步研究

将IL-1023-57-PE40基因与pelB信号肽融合置于pET-20b构建分泌表达质粒pET-20b-IL-1023-57-PE40,然后将pET-20b-IL-1023-57-PE40分别转化至BL21(DE3),BL21(DE3)pLysS,Rosetta(DE3),E·coliK12TB1,ER2566中。无论是在37℃或是在26℃,亦或在培养基中添加葡萄糖的情况下,IPTG诱导后,IL-1023-57-PE40蛋白只在BL21(DE3)pLysS菌中以可溶分泌形式表达,其中以37℃时培养基中不添加葡萄糖表达量为最高,占菌体蛋白总量的15%,说明蛋白的分泌表达与菌种的选择有关。表达产物经免疫印记检测可被抗PE40的特异抗体识别。通过质粒稳定性实验证明,pET-20b-IL-1023-57-PE40在BL21(DE3)中不稳定,导致蛋白的不表达,在Rosetta(DE3)BL21,E·coliK12TB1,ER2566中稳定但不表达,因此,以Rosetta(DE3)BL21为例,通过SDS-PAGE、DNAStar和ANThewin蛋白分析软件对本室构建的几种PE重组毒素进行比较分析,我们发现:并不是所有PE重组毒素融合信号肽序列后,就能分泌表达,PE重组毒素分泌表达还可能与导向部分的性质有关。     

IL-10_(23-57)-PE40可溶表达、纯化及其细胞活性

以IL-10的功能短肽(35肽,即IL10第23至57氨基酸残基)为导向部分与PE40(绿脓杆菌外毒素除去受体结合区后的剩余部分)融合分别置入pet20b(+)和pet28a(+)构建重组毒素IL102357PE40的两种表达质粒,其中置于pet20b(+)的重组毒素在BL21(DE3)pLysS中以周质分泌可溶形式表达,置于pet28a(+)的重组毒素在Rosettablue(DE3)中以高效胞质可溶形式表达;依次通过硫酸铵盐析、疏水层析、阴离子交换层析、铜离子亲和层析纯化周质分泌成份,得90%重组毒素纯品;细胞活性实验表明,该重组毒素只对单核巨噬细胞有杀伤作用;细胞ELISA显示,该重组毒素对单核巨噬细胞的杀伤作用(IC50为13.9pmolL)符合绿脓杆菌外毒素的作用机理.     

TGFα、EGF对绵羊卵母细胞成熟的影响

采用地衣红染色和免疫荧光的方法,观察了培养在基础培养液加BSA、血清、BSA EGF和BSA TGFα四组成熟培养液中绵羊卵母细胞的核成熟状态和α-微管蛋白分布,以及成熟培养后皮质颗粒(CG)的分布情况。结果表明培养22h的上述各组卵母细胞的核成熟率分别为63.5%、75.2%、73.1%、69.8%,处于第一次减数分裂末期的比率分别为27.0%、16.3%、15.9%、16.9%,EGF、TGFα和血清的添加明显提高了核的成熟率(P<0.05),显著减少了处于第一减数分裂末期的比例(P<0.05);α-微管蛋白的正常率(66.6%、66.6%、73.6%)也显著高于BSA组(43.3%)(P<0.05);CG发生迁移较好的卵母细胞比率分别为33.9%、58.8%、54.7%、47.9%,与BSA组相比,EGF和血清的添加明显促进了CG向皮质区的迁移(P<0.05)。实验表明TGFα和EGF均促进了绵羊卵母细胞成熟过程中从第一减数分裂末期向第二减数分裂中期的转变,并且能够替代血清中的某些成分促进和改善体外成熟卵母细胞核成熟的质量,EGF比TGFα更能促进绵羊卵母细胞胞质的成熟。     

IL-1018-57-PE40高效表达、纯化及细胞活性之研究

以IL-10的功能短肽（40肽,即IL-10第18号至57号氨基酸）为导向部分与PE40（绿脓杆菌外毒素除去受体结合区后的剩余部分）融合分别构建了IL-10_18-57-PE40的胞质和胞周质表达质粒,其中,IL-10_18-57-PE40在Rosettablue(DE3)中以高效胞质可溶形式表达,在BL21（DE3）pLysS中以胞周质分泌形式表达;表达宿主菌Rosettablue(DE3)超声波破碎后,依次通过硫酸铵盐析、疏水层析、铜离子亲和层析、阴离子交换层析纯化后,得96%重组毒素纯品;细胞活性实验、细胞ELISA和荧光标记实验表明,构建的IL-10_18-57-PE40符合免疫毒素的作用机理。因此,该实验为PE免疫毒素的规模制备和纯化做了一定的有益的探索。     

胃肠道肿瘤TGF－α基因表达的研究

用分子杂交技术及流式细胞方法研究了转化生长因子α(TGFα)在人胃肠道肿瘤组织中的表达.结果表明,胃癌、结肠癌和直肠癌组织较相应癌旁组织TGFαmRNA水平增高.佛波脂(TPA 100μg/L)作用胃癌细胞MGc80-3后4h,可使细胞中TGFαmRNA水平增高,作用6h可使S期细胞百分比明显增加.这些结果提示:TGFα在胃肠道肿瘤中起重要作用,其表达可受TPA的调节.     

miR-424对雌激素受体α表达的抑制作用

目的:筛选能够抑制在乳腺癌发生中起关键作用的雌激素受体α(ERα)表达的microRNA(miRNA)分子,并在ERα阳性的乳腺癌细胞株中初步检测其生物学功能。方法:在ERα阳性的乳腺癌细胞ZR75-1中转染多种miRNA的表达载体,Western印迹检测ERα的表达水平,找到可以抑制ERα表达的miRNA分子;将该miRNA的表达载体转染ZR75-1后,在雌激素E2的作用下,检测该miRNA分子对细胞生长的影响。结果:经过筛选,得到能够抑制ERα表达的miRNA分子miR-424;生长曲线结果显示,miR-424能够在不依赖于E2的情况下阻抑ZR75-1的生长。结论:该研究为进一步研究miR-424在ERα信号通路中的生物学功能及研究乳腺癌的发生发展机制奠定了基础。     

重组人内皮抑素对食管癌细胞生长抑制作用的体外研究

目的:探讨重组人内皮抑素(rhES)对食管鳞癌系KYSE-150及TE1细胞生长的影响。方法:应用四甲基偶氮唑盐(MTT)法,以大鼠成纤维细胞L929为对照细胞,检测rhES不同浓度(0、12.5、25、50、100、200、400、600μg/ml)和作用时间(24h、48h)对食管鳞癌系KYSE-150、TE1和L929细胞的生长抑制作用。结果:大鼠L929细胞经rhES处理后,吸光度A值轻微降低,差异不具有统计学意义(P>0.05),食管鳞癌系KYSE-150、TE1经rhES处理后,吸光度A值明星降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:rhES明显抑制食管鳞癌系KYSE-150及TE1细胞增殖,且呈时间-剂量依赖性。     

极低频磁场对人肝癌细胞生长、代谢及细胞周期的影响

目的：研究一定参数的极低频磁场对人肝癌细胞（SK-HEP-1）在诸多方面的影响。方法：在整个SK-HEP-1细胞的培养周期中用50Hz,20mT的极低频磁场对其进行作用,并检测作用后细胞的增殖活性、生长动力学、代谢以及细胞周期的变化。结果：50Hz．20mT的极低频磁场对SK-HEP-1细胞的生长与代谢有抑制作用,并能阻碍其有丝分裂的进行。结论：50Hz,20mT的极低频磁场为治疗人类恶性肿瘤提供了一种可能的手段。     

维生素E和微量元素Se对人肝癌细胞生长、分化及其癌基因表达的影响

本工作观察了体外环境中不同水平的维生素Ｅ和微量元素Ｓｅ对人肝癌细胞株（ＳＭＭＣ－７７２１）生长、分化和其癌基因（Ｎ－ｒａｓ、ｃ－ｍｙｃ）表达水平的影响。实验结果表明：高水平维生素Ｅ（２．４、９．２、２４．０ｎｍｏｌ／Ｌ）和Ｓｅ（０．１５、０．３０、０．６０ｎｍｏｌ／Ｌ）对肝癌细胞的集落形成率具有明显的抑制作用;生化分析显示高水平维生素Ｅ和微量元素Ｓｅ均可明显抑制环境中脂质过氧化的水平,Ｓｅ对癌细胞甲胎蛋白的分泌有明显的抑制作用,而维生素Ｅ作用不明显。细胞原位杂交发现维生素Ｅ浓度为２．４和９．２ｎｍｏ１／Ｌ时对细胞癌基因Ｎ－ｒａｓ的表达具有明显抑制作用;Ｓｅ浓度为０．１５和０．３０ｎｍｏｌ／Ｌ时对癌基因ｃ－ｍｙｃ的表达明显抑制。实验还观察了维生素Ｅ和Ｓｅ之间的叠加效应,结果显示除对环境中脂质过氧化的抑制作用具有叠加效果外,对其他指标没有明显作用。     

威灵仙多糖对舌鳞癌细胞生长抑制作用的研究

目的:探讨威灵仙多糖对人舌鳞癌细胞Tca-8113的体外生长抑制作用。方法:提取分离纯化威灵仙多糖,用噻唑蓝(MTT)法测定在不同浓度威灵仙多糖作用下人舌鳞癌细胞Tca-8113的活力,观察药物对癌细胞的生长抑制作用。结果:威灵仙多糖对Tca-8113的生长具有明显的抑制作用,随着威灵仙多糖浓度的增大或作用时间延长,抑制作用逐渐增强,呈一定的剂量和时间依赖关系。结论:在体外实验中,威灵仙多糖对人舌鳞癌细胞Tca-8113具有明显的杀伤和抑制作用,可进一步研究其作为抗肿瘤药物应用于临床的潜力。     

甲胎蛋白在体外对人肝癌细胞生长的影响

本文用MTT比色法观察了甲胎蛋白(AFP)在体外对人肝癌细胞生长的影响。结果表明,AFP能促进SMMC-7721人肝癌细胞的生长。当AFP与AFP抗体合用时,AFP抗体能减弱AFP对SMMC-7721细胞生长的促进作用;AFP抗体单用对此种细胞的生长亦有抑制作用。另一方面,在相同的实验条件下,AFP和AFP抗体对HL-60人白血病细胞的生长无明显影响;提示AFP的促生长作用具有一定的肿瘤细胞特异性,并非一种蛋白质对培养细胞的非特异性营养作用。此外,AFP亦能促进MCF-7人乳腺癌细胞的生长,AFP抗体对此种细胞的生长有抑制作用。由于MCF-7细胞存在功能性AFP受体,也能合成和分泌AFP。这就提示,人肝癌细胞中的AFP很可能与其受体特异性结合,产生促生长效应。确切机制尚待进一步阐明。     

α-SMA在培养生长板软骨细胞中的表达

目的探讨α-SMA在原代培养生长板软骨细胞中的表达及传代培养对其表达的影响。方法分离、培养大鼠肋生长板软骨细胞(rat costochondral growth plate chondrocyte,RGC),免疫细胞化学(ICC)和Western blot分别对1-5代RGC中α-SMA的表达进行定性和半定量分析。结果原代培养的RGC不表达α-SMA,随着传代次数的增加,α-SMA阳性染色的细胞比例从原代的0增加到第5代的24.2±4.3%(n=3),Western blot结果与ICC结果一致。结论本研究首次发现原代培养的RGC并不表达α-SMA,随着RGC传代次数的增加,表达α-SMA的细胞比例和表达量不断升高。     

可溶性CD40配体的表达及其对树突状细胞和恶性B？…

ＣＤ４０配体（ＣＤ４０Ｌ）是ＴＮＦ超家族成员,表达于人活化的ＣＤ４＾＋Ｔ细胞表面,与存在于Ｂ细胞、抗原递呈细胞表面的相就受体ＣＤ４０分子相互作用,促发并调节机体的体液免疫和细胞免疫应答。用ＰＣＲ法从ＣＤ４０Ｌ全长ｃＤＮＡ质粒中扩增ＣＤ４０Ｌ胞外段编码ｃＤＮＡ,即可溶性ＣＤ４０Ｌ（ｓＣＤ４０Ｌ）编码ｃＤＮＡ,并克隆入ｐＳＫ质粒;ｃＤＮＡ序列经测序证实后与ｐＰＩＣＺαＡ质粒重组构建成ｐＰＩＣＺαＡ－ｓ     

人睾丸发生过程中TGF β1表达的研究

研究 TGFβ1 (转化生长因子β1 )在人胚胎睾丸发生过程中的表达。收集 30例 12 - 32周龄胎儿睾丸标本 ,免疫组织化学 ABC法染色 ,以正常羊血清代替一抗为阴性对照 ,TGFβ1 抗血清的工作浓度为 1:10 0 ,光镜观察。结果显示 TGFβ1 在人胚胎睾丸间质细胞呈阳性表达 ,曲细精管内精原细胞、支持细胞、管周肌样细胞未见阳性表达。TGFβ1 在 12周龄睾丸组织未见阳性表达 ,16周～ 32周均有阳性表达 ,在 16周时是表达的高峰 ,此后呈逐渐下降趋势 (P<0 .0 1)。由此结果表明TGFβ1 可能在人睾丸发生过程中有重要作用     

人肝癌细胞株中EGFR的表达和EGF对肝癌细胞生长的促进

本文分析了人肝癌细胞株7404,7721细胞中表皮生长因子受体(EGFR)基因表达和EGF对肝癌细胞生长的促进作用。~(125)Ⅰ-EGF对7404细胞的结合试验表明结合是可饱和的和专一的,从~(125)Ⅰ-EGF对7404、7721细胞结合浓度曲线作Scatchard作图和计算,提示每个7404和7721细胞表面分别有1.1×10~5和0.7×10~5的EGFR分子。Northern杂交分析证明EGFR基因在7404,7721细胞中的转录产物主要是5.6 kb EGFR mRNA,免疫印迹分析证明7404细胞和7721细胞的EGFR为170kd的蛋白。EGF对培养于含10%或0.5%小牛血清的RPMI-1640培液中的7404、7721细胞的贴壁依赖性生长有促进作用,促进作用的程度与培液中CS含量有一定关系,提示EGF的促生长作用可能是EGF与血清中其他成分协同作用的结果。EGF对培养于软琼脂中的7404,7721细胞的贴壁不依赖性生长也有明显促进作用。综合上述实验结果说明EGFR基因在人肝癌细胞中是活跃表达的,EGF可能是肝癌细胞生长依赖的一个重要有丝分裂原。