小鼠胚胎干细胞p16INK4a基因外显子1α打靶研究

在活体水平上 ,小鼠p16 INK4a基因是否具有抑制肿瘤发生和发展的功能是一个悬而未决的问题。利用筛选基因组文库得到的小鼠p16 INK4a基因组DNA片段 ,构建了针对小鼠p16 INK4a 基因外显子 1α的基因打靶载体 ,其短臂为1.5kbEco81Ⅰ AccⅡ片段 ,长臂为 5 .9kbXbaⅠ XhoⅠ片段。打靶载体经线性化和纯化后通过电穿孔转导小鼠R1ES细胞 ,获得 37个G418和Gancyclovir双药抗性克隆。用Southern杂交法对双药抗性克隆进行鉴定 ,获得一个敲除了p16 INK4a基因外显子 1α的阳性ES细胞克隆。     

小鼠p16^INK4a基因位点的结构和功能研究

p16^INK4a基因的失活与多种肿瘤的发生和发展有联系。通过筛选小鼠基因组文库,获得长度为14.5kb的p16^INK4a基因组DNA片段。对上述14.5kbDNA 测序后进行生物信号学分析表明：该片段包含3个外显子,编码1个由168个氨基酸残基组成的多肽,其相对分子质量的理论计算值为17941,有7个可能的磷酸化位点,说明p16^INK4a蛋白的功能可能受到磷酸化的调控。该DNA片段的非编码区分布着大量短散布元件、长散布元件和简单重复序列,这样的结构为转座和同源重组提供了结构基因,提示了部分肿瘤细胞中p16^INK4a基因缺失的可能原因。对第一外显子离列与巳发表的相应序列比较发现其DNA序列和所编码的多肽存在多态性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5a多克隆抗血清的制备

构建XX2012株猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)GP5a蛋白基因的真核表达载体,并制备出GP5a蛋白的多克隆抗血清。以XX2012株PRRSV GP5a蛋白的基因序列为扩增模板,设计并合成一对特异性扩增引物,通过RTPCR扩增得到该病毒株的GP5a蛋白全长基因片段,将其定向克隆到真核表达载体p CAGG中,构建含有GP5a蛋白基因的重组表达载体p CAGGS-GP5a,并将获得的p CAGGS-GP5a载体采用基因免疫的方式免疫BALB/c小鼠制备GP5a蛋白的多克隆抗体。结果显示,成功克隆出了XX2012株PRRSV GP5a蛋白全长基因,片段大小为156 bp;构建的p CAGGS-GP5a载体经PCR、双酶切、测序鉴定均无误;通过三次基因免疫小鼠成功制备出了GP5a蛋白的多克隆抗体,间接免疫荧光试验证实制备出的多克隆抗体能特异性识别病毒感染后的细胞。由此获得了PRRSV GP5a蛋白基因的真核表达载体,制备出了GP5a蛋白的特异性多克隆抗血清,为今后开展GP5a蛋白的亚细胞定位及相关功能的研究奠定了基础。     

小鼠锌指蛋白基因ZF-12基因剔除的ES细胞系的建立

利用小鼠锌指蛋白ZF－12基因组DNA片段,构建了针对小鼠ZF－12基因座的替换型打靶载体pSSC-TV-10.5。经限制性核酸内切酶酶切及部分测序鉴定其结构正确后,通过电穿孔将线性化打靶载体导入ES人,经G418／GANC双药筛选和分子鉴定,获得4个ZF－12^ /-基因的ES细胞杂合子克隆,其生长状态良好,为进一步建立ZF－12基因剔除的小鼠动物模型创造了条件。     

人t-PA突变体cDNA打靶敲入小鼠ES细胞β-酪蛋白位点的研究

应用克隆的基因组序列作为同源臂 ,构建了小鼠 β 酪蛋白基因定位敲入打靶载体。短臂长 2 7kb ,包括小鼠 β 酪蛋白基因 5′端侧翼区、第 1外显子、第 1内含子、部分第 2外显子。长臂包括小鼠 β 酪蛋白基因部分第 2内含子、第 3～ 7外显子、第 3～ 6内含子、部分第 7内含子 ,长 3 4kb。人t PA突变体cDNA在第 2外显子中与小鼠 β 酪蛋白信号肽序列融合。正筛选标记neo放置在 β 酪蛋白基因第 2内含子中部 ,负筛选标记tk位于短臂外侧。ES细胞株TC 1在滋养层上培养扩增。处理ES细胞使其密度达到 2× 10 7个 /mL后 ,将 4 5 μg线性化的打靶载体DNA与 1mL细胞混匀后电击。转染的细胞在含G4 18和Gancyclovir的选择培养基中培养 ,7d后挑取 192个抗性克隆 ,扩增、提取基因组DNA ,EcoRⅠ酶切后 ,用打靶载体 5′端内侧探针进行Southern杂交 ,野生型出现 9 8kb ,而中靶的 β 酪蛋白基因由于敲入的人t PA突变体携带一个EcoRⅠ位点 ,中靶等位基因出现 6 6kb。从 78株ES细胞株中获得 1株发生正确同源重组的中靶ES细胞。     

低钾型周期性麻痹相关的Cchl1a3基因R528H敲入小鼠模型的构建

目的：构建低钾型周期性麻痹相关的Cchl1a3基因R528H敲入小鼠模型。方法将 Cchl1a3-knock-in打靶载体电转染ES细胞,经过G418和Ganciclovoir筛选阳性ES细胞克隆并用PCR和DNA测序法鉴定。将阳性ES克隆注射到小鼠囊胚,获得嵌合体小鼠。通过杂交获得的杂合子小鼠与FLP小鼠交配繁育获得去neo杂合子小鼠,并用PCR和DNA测序进行鉴定。将去neo杂合子小鼠交配得到纯合子后代,进行生长发育等方面的观察。结果打靶载体成功转染ES细胞,PCR和DNA测序法证实9个ES细胞克隆发生正确的同源重组。通过显微注射获得7只嵌合体小鼠。将嵌合体小鼠交配繁育的杂合子小鼠和FLP小鼠交配获得9只去neo杂合子小鼠,最终得到15只去neo纯合子小鼠。该小鼠在发育至性成熟阶段,精神、饮食及活动状态良好,但是在4个月龄时逐渐出现脱毛,皮肤破溃甚至死亡。结论成功构建Cchl1a3基因 R528H 突变的纯合子小鼠,为研究人类CACNA1S基因功能和阐明低钾型周期性麻痹发生的分子机制奠定了基础。     

小鼠p16~(INK4a)基因位点的结构和功能研究

p1 6INK4a基因的失活与多种肿瘤的发生和发展有联系。通过筛选小鼠基因组文库 ,获得长度为 1 4.5kb的p1 6INK4a基因组DNA片段。对上述 1 4.5kbDNA测序后进行生物信息学分析表明 :该片段包含 3个外显子 ,编码 1个由 1 68个氨基酸残基组成的多肽 ,其相对分子质量的理论计算值为 1 7941 ,有 7个可能的磷酸化位点 ,说明p1 6INK4a蛋白的功能可能受到磷酸化的调控。该DNA片段的非编码区分布着大量短散布元件、长散布元件和简单重复序列 ,这样的结构为转座和同源重组提供了结构基础 ,提示了部分肿瘤细胞中p1 6INK4a基因缺失的可能原因。对第一外显子序列与已发表的相应序列比较发现其DNA序列和所编码的多肽存在多态性     

慢病毒介导Nanog基因在小鼠ES细胞的表达

试验尝试构建小鼠Nanog基因慢病毒表达载体,培养表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞。结果显示通过RT-PCR扩增出918bp的小鼠Nanog基因,测序正确的小鼠Nanog基因通过慢病毒介导在小鼠ES细胞表达后,表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞生长状态同普通ES细胞无明显差异,在无LIF的ES细胞培养液培养条件下,表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞保持正常的ES细胞集落,碱性磷酸酶、Oct4和SSEA-1免疫细胞化学检测为阳性,相同情况下未表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞集落退化消失。试验证实了通过慢病毒载体介导培养了表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞。试验尝试构建小鼠Nanog基因慢病毒表达载体,培养表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞。根据小鼠Nanog基因m RNA序列设计Nanog基因引物,引物两端带有Nhe I和Xho I酶切位点。Trizol试剂处理小鼠ES细胞,通过RT-PCR扩增出小鼠Nanog基因,小鼠Nanog基因用Nhe I和Xho I酶切后连入pcDNA3.1载体中,PCR检测阳性的细菌克隆进行测序,测序正确的Nanog基因片段连接入PLL-IRES-Neo慢病毒表达载体中,包装含有Nanog基因的慢病毒感染小鼠ES细胞,在SNL细胞饲养层上G418筛选2周后,添加普通ES细胞培养液在普通小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上培养。结果显示通过RT-PCR扩增出918 bp的小鼠Nanog基因,测序正确的小鼠Nanog基因通过慢病毒介导在小鼠ES细胞表达后,表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞生长状态同普通ES细胞无明显差异,在无LIF的ES细胞培养液培养条件下,表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞保持正常的ES细胞集落,碱性磷酸酶、Oct4和SSEA-1免疫细胞化学检测为阳性,相同情况下未表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞集落退化消失。试验证实了通过慢病毒载体介导培养了表达外源Nanog基因的小鼠ES细胞。     

细胞衰老的重要通路:p16INK4a/Rb和p19ARF/p53/p21Cip1信号途径

细胞周期蛋白依赖激酶（cyclin-dependent kinase,CDK)抑制因子p16^INK4a,p21^Cipl等是细胞衰老的关键效应物。本文对涉及这些抑制物的两条衰老诱导途径作一综述,它们是p16^INK4a/Rb和p19^ARF/p53/p21^Cipl信号途径。其中,几个抑癌基因的产物R ,16^INFK4a,p53及p19^ARF处于两条途径的核心位置。