人STC2蛋白的生物学分析

运用生物信息学方法预测分析不同物种间STC2蛋白的理化性质、同源性以及人STC2蛋白亲水性、核定位序列,跨膜区域、信号肽结构、亚细胞定位,二级结构、三级结构、互作蛋白、GO注释分析。STC2蛋白由302个氨基酸组成,理论等电点为6.93,具有较强亲水性,在哺乳动物中较为保守,不存在核定位序列和跨膜结构,含有信号肽,主要集中在细胞内质网或分泌到胞外;STC2蛋白二级结构预测有11个α螺旋区和1个β折叠区,拉曼图表明三级预测结构可靠,互作蛋白及GO注释提示STC2可参与多种细胞生物学过程。通过对人STC2蛋白结构和功能的预测分析,为STC2蛋白的进一步研究提供一定的理论依据,也为STC2相关疾病的诊治提供新的思路。     

基于生物信息学方法预测人线粒体转录终止因子3蛋白的结构与功能

目的:基于生物信息学预测人线粒体转录终止因子3(hMTERF3)蛋白的结构与功能。方法:利用GenBank、Uniprot、ExPASy、SWISS-PROT数据库资源和不同的生物信息学软件对hMTERF3蛋白进行系统研究,包括hMTERF3的理化性质、跨膜区和信号肽、二级结构功能域、亚细胞定位、蛋白质的功能分类预测、同源蛋白质多重序列比对、系统发育树构建、三级结构同源建模。结果:软件预测hMTERF3蛋白的相对分子质量为47.97×103,等电点为8.60,不具信号肽和跨膜区;二级结构分析显示主要为螺旋和无规则卷曲,包含6个MTERF基序,三级结构预测结果与二级结构预测结果相符;亚细胞定位分析结果显示该蛋白定位于人线粒体;功能分类预测其为转运和结合蛋白,参与基因转录调控;同源蛋白质多重序列比对和进化分析显示,hMTERF3蛋白与大鼠、小鼠等哺乳动物的MTERF3蛋白具有高度同源性,在系统发育树上聚为一类。结论:hMTERF3蛋白的生物信息学分析为进一步开展对该蛋白的结构和功能的实验研究提供了理论依据。     

番茄OPA3-like基因的生物信息学分析及原核表达

[目的]获得高效表达的类视神经萎缩蛋白3(OPA3-like),并分析其生物信息学功能。[方法]利用Vector NTI和ExPASy,Signal P,Plant-mPLoc等在线工具对OPA3-like蛋白基本理化性质、信号肽、跨膜区及亚细胞定位进行分析;构建原核表达载体pET22b-OPA3-like、pET28a-OPA3-like、pET32a-OPA3-like并分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)中,经IPTG诱导融合蛋白表达,SDS-PAGE对结果进行验证。[结果]OPA3-like蛋白是不稳定蛋白,含有跨膜区,可能位于叶绿体;原核表达表明,对于同一重组质粒而言,融合蛋白在两种菌中的表达量无明显差别,其中,转化pET28a-OPA3-like可表达20kDa的融合蛋白;转化pET32a-OPA3-like可表达37kDa的融合蛋白,且主要都以包涵体形式存在,转化pET22b-OPA3-like无融合蛋白的表达。[结论]转化pET32a-OPA3-like的表达菌可以高效表达融合蛋白(37 kDa),有利于进一步研究OPA3-like在植物中的亚细胞定位及功能。     

三穗麻鸭MT基因克隆与序列分析

目的:为三穗麻鸭金属硫蛋白(MT)的结构与功能研究提供基础材料。方法:应用MT特异引物,通过RT-PCR从三穗麻鸭肝组织总RNA中扩增目的基因,克隆测序后应用生物信息学软件对该编码蛋白二级结构、亚细胞定位、跨膜结构及信号肽进行预测。结果:三穗麻鸭MT基因全长185bp,可编码61个氨基酸,其中半胱氨酸19个,丝氨酸9个,不含芳香族氨基酸;该基因序列与绿头鸭MT基因的核苷酸同源性为99%,氨基酸同源性达100%;该蛋白为可溶性蛋白,可分布细胞核内和核外,不含信号肽。结论:首次克隆出三穗麻鸭金属硫蛋白基因。     

甘蔗β-1,3-葡聚糖酶基因的电子克隆与分析

以高粱β-1,3-葡聚糖酶基因(β-1,3-glucanase gene)cDNA序列为探针,搜索甘蔗EST数据库,而后通过电子克隆技术,拼接获得甘蔗β-1,3-葡聚糖酶基因ScBG。采用生物信息学方法,对该基因编码蛋白从氨基酸组成、理化性质、跨膜结构域、卷曲螺旋、亚细胞定位、信号肽、功能域及高级结构等方面进行了预测和分析。结果表明:ScBG基因全长1270bp,包含一个长达1011bp的完整开放读码框(open reading frame,ORF),编码336个氨基酸,分子量为34.8KD,理论等电点为4.98。该蛋白质很可能是胞外定位的诱导物释放型酸性葡聚糖酶,是一种稳定的分泌蛋白,且可信度达最高等级1。该蛋白属于糖苷水解酶第17家族,含有N端信号肽,在第7～29位氨基酸处含有跨膜信号区,在第31～321位氨基酸处含有糖苷水解酶17家族结构域,含2个主要的功能结构域。10个物种ScBG蛋白氨基酸序列的同源性分析表明,甘蔗ScBG基因编码蛋白与高粱β-1,3-葡聚糖酶基因的编码蛋白的同源性最高,达79.82%。以上研究结果为ScBG基因下一步的分子克隆、功能鉴定和应用提供基础。     

家蝇Prohibitin基因的生物信息学分析

为对家蝇Prohibitin蛋白序列进行生物信息学分析,从而为该基因功能研究奠定基础。利用在线分析程序和相关工具软件分析Prohibitin蛋白的理化性质、结构域、并预测其空间结构和功能。结果表明家蝇Prohibitin蛋白由277个氨基酸组成,分子量为30.54 k Da,理论等电点为5.26,为稳定蛋白,有跨膜区,但不含信号肽,该蛋白属于PHB保守结构域家族,亚细胞定位于细胞质,二级结构以α-螺旋为主。蛋白同源性比对结果显示,昆虫中的Prohibitin蛋白具有较高的同源性。这些分析结果可为今后深入研究该蛋白的结构特征和功能提供参考。     

人转录因子AP4的生物信息学分析

[目的]预测分析人转录因子激活增强子结合蛋白4(activating enhancer binding protein 4,AP4)的性质、结构和功能。[方法]采用生物信息学方法对人AP4蛋白的理化性质、物种间同源性、信号肽与跨膜区、亲水性、蛋白亚细胞定位、蛋白质二/三级结构、三级结构可靠性、蛋白质相互作用等方面进行预测和分析。[结果]人AP4蛋白全长338个氨基酸,理论等电点5.63,相对分子质量38.73 kDa。AP4在进化上较为保守,不含信号肽与跨膜区,属于亲水性蛋白质,94.1%可信度定位于细胞核。二级结构含10个α螺旋区,占全部氨基酸的54.14%,5个β折叠区,占7.99%,其余37.87%的氨基酸处于无规卷曲状态。三维建模结果可靠。预测到10个与AP4存在相互作用的蛋白。[结论]系统预测分析了人AP4蛋白的性质、结构和功能。     

剑尾鱼P-糖蛋白基因全长cDNA克隆、分析及组织分布

P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)为ABC转运体超家族的主要成员,分布于细胞膜,依赖ATP供能,可将细胞内的亲脂性毒物或药物逆浓度泵出胞外,在机体解毒上具重要功能。研究采用RT-PCR和RACE法对剑尾鱼P-gp基因进行克隆并获得了全长cDNA序列4301 bp,该基因编码1286个氨基酸残基,估算编码蛋白的分子质量为141.64 kD。生物信息学分析表明,剑尾鱼P-gp不含信号肽序列,具ATP转运家族蛋白的典型结构域,包括2个疏水性的跨膜区(Transmembrane domains, TMD)和2个位于细胞浆内的核苷酸结合区(Nucleotide-binding domains, NBD),为全转运子,每个跨膜区都有6个跨膜α螺旋,而每个NBD包含1个ABC转运体家族标记序列;跨膜性质预测结果显示该蛋白属膜蛋白,具P-gp的典型特征。序列同源性分析发现,不同进化地位动物P-gp存在高度同源性,显示P-gp在系统进化上高度保守。P-gp在剑尾鱼肝脏、肾脏、脑等不同组织均有表达,其中以肝脏的相对表达量最高,是P-gp检测的代表组织。QRT-PCR实验表明,苯并(a)芘胁迫可明显诱导P-gp mRNA的表达。剑尾鱼P-gp的表达水平或可作为一个生物标记物指标,应用于环境持久性有机污染物的监测研究中。     

RT-PCR克隆籼稻叶绿素a/b结合蛋白基因全长cDNA及序列的in silico分析

根据日本晴cab4基因序列(GenBank:AK104499.1)设计引物,用RT-PCR的方法从籼稻9311中克隆了叶绿素a/b结合蛋白基因的全长cDNA,命名为cab-9311(cab gene from 9311)。insilico分析表明:cab-9311与cab4基因同源性为99%,编码的蛋白含有244个氨基酸,与cab4基因编码的蛋白同源性为98%。蛋白分子质量为26.9kD,理论等电点为6.52。第54位～第216位氨基酸是一个典型的叶绿素a/b结合蛋白功能域(chlorophyll a/bbinding domain)。跨膜分析和蛋白质三级预测显示,该蛋白在C端有一个典型的跨膜区。亚细胞定位分析表明该蛋白定位于叶绿体,是一个叶绿体内囊体膜上的锚定蛋白。     

猪链球菌2型新的感染相关因子自溶素的鉴定与分析

根据Sanger研究所公布的猪链球菌2型(SS2)P1/7株的自溶素序列,设计检测引物,取SS2我国2次流行株、其它临床分离株和参考株,及猪链球菌1型、1/2型、7型和9型,共33株,分别以其DNA为模板,PCR扩增.结果表明,SS2除无毒株T15阴性外,其他临床分离株27株(含人源2株)均阳性;其它猪链球菌为,SS7阳性,SS1、SS1/2和SS9均阴性.同时设计引物向两侧扩增,以四川流行株ZY05719和江苏流行株HA9801的DNA为模板,扩增自溶素ORF完整的编码基因,软件分析结果显示,该基因含有6个重复的"GBS_Bsp-like"域和1个"N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶"域,与SS2欧洲株有较高同源性(99.8%),但与SS2加拿大株差异较大.在DNASTAR分析所编码蛋白的抗原性的基础上,另设计引物,以ZY05719株DNA为模板,PCR扩增具有良好免疫原性的片段基因,并定向克隆至表达载体pET30a( )中,进行重组表达,SDS-PAGE和Western blot表明,所获得重组自溶素具有良好反应原性.     

Construction and Characterization of a Streptococcus suis Serotype 2 Recombinant Expressing Enhanced Green Fluorescent Protein

Streptococcus suis serotype 2 (S. suis 2) is an important pathogen, responsible for diverse diseases in swine and humans. To obtain a S. suis 2 strain that can be tracked in vitro and in vivo, we constructed the Egfp-HA9801 recombinant S. suis 2 strain with egfp and spc(r) genes inserted via homologous recombination. To assess the effects of the egfp and spc(r) genes in HA9801, the biochemical characteristics, growth features and virulence in Balb/C mice were compared between the recombinant and the parent HA9801 strain. We detected the EGFP expression from Egfp-HA9801 by epifluorescence microscopy. The results showed that the biochemical characterization and growth features of the Egfp-HA9801 recombinant were highly similar to that of the parent HA9801. We did not find significant differences in lethality (50% lethal dose), morbidity and mortality between the two strains. Furthermore, the bacterial counts in each various tissues of Egfp-HA9801-infected mice displayed similar dynamic compared with the HA9801-infected mice. Our results also showed that the Egfp-HA9801 cells grown at 37°C for 36 h displayed greater green fluorescence signals than the cells grown at 28°C for 36 h and 37°C for 24 h. The fluorescence in the tissue cryosections of Egfp-HA9801-injected mice was also stronger than that of the HA9801 group. Together, these results indicate that the egfp and spc(r) insertions into the Egfp-HA9801 recombinant did not significantly change the virulence when compared with HA980, and this EGFP labeled strain can be used for future S. suis 2 pathogenesis research.     

猪链球菌2型对扁桃腺上皮细胞的黏附和侵袭作用

猪链球菌2型(SS2)是重要的人畜共患病病原体,溶菌酶释放蛋白（MRP）是SS2的主要毒力因子之一。用天然表达MRP的江苏分离株HA9801和不表达MRP的上海分离株SH006444,研究SS2对仔兔扁桃腺上皮细胞的黏附和侵袭作用。黏附计数结果表明,HA9801（MRP+）和SH006444（MRP-）均能对扁桃腺上皮细胞高水平黏附。扫描和透射电镜均观察到HA9801的高水平黏附现象,黏附部位是细胞膜和细胞微绒毛,并观察到细胞膜上有链球菌正处于内化过程中。裂解记数结果表明,HA9801有低度侵袭力,SH006444未检测到侵袭力。结果提示,扁桃腺是SS2的定殖器官和感染门户;MRP＋菌株黏附后直接侵入细胞内是其穿过扁桃腺上皮细胞屏障的机制之一。     

Characterization and functional analysis of atl, a novel gene encoding autolysin in Streptococcus suis

Streptococcus suis serotype 2 (S. suis 2) is an important swine and human pathogen responsible for septicemia and meningitis. A novel gene, designated atl and encoding a major autolysin of S. suis 2 virulent strain HA9801, was identified and characterized in this study. The Atl protein contains 1,025 amino acids with a predicted molecular mass of 113 kDa and has a conserved N-acetylmuramoyl-l-alanine amidase domain. Recombinant Atl was expressed in Escherichia coli, and its bacteriolytic and fibronectin-binding activities were confirmed by zymography and Western affinity blotting. Two bacteriolytic bands were shown in the sodium dodecyl sulfate extracts of HA9801, while both were absent from the atl inactivated mutant. Cell chains of the mutant strain became longer than that of the parental strain. In the autolysis assay, HA9801 decreased to 20% of the initial optical density (OD) value, while the mutant strain had almost no autolytic activity. The biofilm capacity of the atl mutant was reduced ～30% compared to the parental strain. In the zebrafish infection model, the 50% lethal dose of the mutant strain was increased up to 5-fold. Furthermore, the adherence to HEp-2 cells of the atl mutant was 50% less than that of the parental strain. Based on the functional analysis of the recombinant Atl and observed effects of atl inactivation on HA9801, we conclude that Atl is a major autolysin of HA9801. It takes part in cell autolysis, separation of daughter cells, biofilm formation, fibronectin-binding activity, cell adhesion, and pathogenesis of HA9801.     

猪链球菌2型的纤连蛋白/血纤维蛋白原结合蛋白基因的序列分析

目的 为确定猪链球菌2型(SS2)江苏分离株9801是否具有纤连蛋白／血纤维蛋白原结合蛋白基因(fbps)。方法 根据已发表的SS2 fbps序列,设计并合成1对引物,以SS2江苏分离株的基因组为模板,采用聚合酶链反应(PER)方法扩增fbps,克隆于pMD-T18载体。测定阳性质粒插入序列。利用DNAstar软件,比较所测序列与不同来源SS2的fbps和FBPS与链球菌属其他种同源蛋白的同源性。结果 扩增的fbps为1 938 bp,江苏分离株与猪源致病性SS2荷兰分离株的fbps序列有5个碱基不同,与ATCCA3765株有3个碱基不同,同源性均达99．99％以上。推导的氨基酸序列比较,分别有4个和2个氨基酸不同,同源性均为99％以上。纤连蛋白结合蛋白(FBPS)无前导序列,无锚定序列,与链球菌属其他种的同源Fn结合蛋白的同源性为68．8％～76．0％。结论 FBPS是一种无锚的黏附素。     

禽流感病毒H5N1血凝素基因和神经氨酸酶基因在大肠杆菌中的表达

目的：克隆、表达和鉴定禽流感病毒H5N1血凝素基因（hemagglutinin,HA）和神经氨酸酶基因（neuramidinase,NA）序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。方法：在成功克隆禽流感病毒H5N1全长HA、NA基因并测序的基础上,将部分基因序列克隆到表达载体pET32a（＋）上,全基因序列克隆到表达载体pGEX4T-1上,构建了重组表达质粒pET32a（＋）/HA(49~1587bp)、pET32a（＋）/NA(121~1141bp)、pGEX4T-1/HA、pGEX4T-1/NA,转化大肠杆菌BL21/rosetta,IPTG诱导表达,利用Ni2＋亲和层析柱和GSTra P4B亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western blotting和ELISA方法检测其抗原性。结果：重组蛋白在大肠杆菌中可以高效达,SDS PAGE显示其相对分子质量与预计大小一致,蛋白纯度占总蛋白的90％以上。ELISA和Western blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。结论:成功克隆和表达了禽流感病毒H5N1 HA、NA基因序列,为禽流感病毒H5N1诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究奠定了基础。     

Hyaluronic acid promotes angiogenesis by inducing RHAMM-TGFβ receptor interaction via CD44-PKCδ

Hyaluronic acid (HA) has been shown to promote angiogenesis. However, the mechanism behind this effect remains largely unknown. Therefore, in this study, the mechanism of HA-induced angiogenesis was examined. CD44 and PKCδ were shown to be necessary for induction of the receptor for HA-mediated cell motility (RHAMM), a HA-binding protein. RHAMM was necessary for HA-promoted cellular invasion and endothelial cell tube formation. Cytokine arrays showed that HA induced the expression of plasminogen activator-inhibitor-1 (PAI), a downstream target of TGFβ receptor signaling. The induction of PAI-1 was dependent on CD44 and PKCδ. HA also induced an interaction between RHAMM and TGFβ receptor I, and induction of PAI-1 was dependent on RHAMM and TGFβ receptor I. Histone deacetylase 3 (HDAC3), which is decreased by HA via rac1, reduced induction of plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) by HA. ERK, which interacts with RHAMM, was necessary for induction of PAI-1 by HA. Snail, a downstream target of TGFβ signaling, was also necessary for induction of PAI-1. The down regulation of PAI-1 prevented HA from enhancing endothelial cell tube formation and from inducing expression of angiogenic factors, such as ICAM-1, VCAM-1 and MMP-2. HDAC3 also exerted reduced expression of MMP-2. In this study, we provide a novel mechanism of HA-promoted angiogenesis, which involved RHAMM-TGFβRI signaling necessary for induction of PAI-1.     

H5N1亚型AIVHA抗原表位的高效表达及其抗原活性分析

血凝素(hemagglutinin,HA)蛋白是禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的一个重要表面抗原性蛋白,在疾病诊断和防治上有重要意义。本研究为了探讨一种更为简便有效的HA重组蛋白表达途径,利用生物信息学软件,对H5N1亚型AIVHA基因编码的氨基酸序列进行分析,在分析其在大肠杆菌中的密码子偏好性、稀有密码子分布情况及有关蛋白的抗原性等重要特性后,构建了HA抗原表位重组表达质粒pET-32a(+)-HA。经测试,该重组质粒在1mmol/LIPTG诱导剂作用下诱导过夜,能在大肠杆菌Rosetta-gami B(DE3)中高效表达,并得到48.1kD大小的目的重组表达蛋白。重组蛋白用6×His-tagged protein纯化试剂盒纯化后,与福氏佐剂等量混合制备成抗原,以200μg/鸡的剂量皮下注射2月龄SPF鸡3次,采血分离血清。Western-Blot试验结果表明,该重组表达蛋白能分别与所制备的高免鸡血清及H5N1亚型AIV阳性血清发生特异性反应,在硝酸纤维素膜上出现特异性杂交带。说明本试验研究的HA抗原重组表达蛋白具有良好的免疫原性和反应原性,保留了HA蛋白的抗原活性,提示该重组蛋白在H5亚型AIV的防治技术研究中具有重要的实际应用价值。     

禽流感病毒H9N2血凝素基因和神经氨酸酶因在大肠杆菌中的表达

克隆、表达和鉴定禽流感病毒H9N2 HA,NA基因序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。在成功克隆禽流感病毒H9N2全长HA、NA基因并测序的基础上,将部分基因序列克隆到表达载体pET32a(+)上,全基因序列克隆到表达载体pGEX4T-1上,构建了重组表达质粒pET32a(+)/HA(截短)、pET32a(+)/NA(截短)、pGEX4T-1/HA、pGEX4T-1/NA,转化大肠杆菌BL21/rosetta,IPTG诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱和GSTrap4B亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western Blotting和ELISA方法检测其抗原性。结果重组蛋白在大肠杆菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量与预计大小一致。ELISA和Western Blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。本研究成功克隆和表达了禽流感病毒H9N2 HA、NA基因序列。为禽流感病毒H9N2诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究奠定了基础。