食源性致病菌高通量检测方法及应用

食源性致病菌的体外培养一直是病原体诊断的金标准,但按照目前的培养技术仅有1％的细菌可以培养.目前用于病原微生物鉴定的高通量检测技术主要有:多重PCR技术、实时荧光定量PCR技术、核酸等温扩增技术、焦磷酸测序技术和芯片技术等,本文介绍了这些高通量检测技术及其在食品病原微生物检测方面的应用情况.     

用于高通量测序未知病原体分析的样本预处理方法及扩增方案概述

2005年以来,二代测序平台和测序技术越来越普及,被广泛用于新病毒和未知病原体的发现,从未经培养的复杂样本中筛查病毒类病原体需要更多的前期处理措施。我们围绕高通量测序所涉及到的测序样本预处理方法和扩增方法做简要总结:样品类型分为无菌样本和开放样本;病原体类型包括病毒、细菌、真菌等;背景核酸去除的常用方法包括物理分离、核酸酶消化和几种r RNA去除的方法;常用的微量样本非特异性扩增方法包括随机引物PCR、SISPA技术、锚定随机引物PCR、RCA技术、MDA技术和NASBA技术。     

重要肠道病原菌多重PCR-基因芯片检测方法研究

目的:建立并初步评价一种针对重要肠道病原菌的多重PCR 基因芯片检测方法。方法：对筛选出的特异引物进行多重PCR优化,将引物分别按种属内混合和种属间混合的方案排查引物间的竞争性抑制现象,再将不同菌属的模板混合,用相对应的混合引物扩增,探寻高效特异的引物组合。分别掺入和不掺入荧光素,验证其对混合PCR反应的影响,并与芯片杂交,探寻多重PCR扩增效率对芯片杂交的影响。分析不同数量引物组合产生的杂交结果,筛选出无交叉反应的最优引物组合。结果:种属内引物混合均得到特异性扩增结果。种属间混合霍乱弧菌和空肠弯曲菌得到部分预期条带,随着混合引物数量的增加,交叉抑制现象也增多。杂交信号强度随多重PCR扩增效率的增加而增强。反应中掺入荧光素的扩增条带产量低于无荧光素的产物。可将35对混合引物拆成3个体系分别标记样品,以避免假阴性结果。结论:PCR反应中掺入荧光素降低扩增效率和杂交效率,但并不影响对杂交结果的判读和数据分析。基因芯片杂交信号强度取决于多重PCR的扩增效率。肠道病原菌多重PCR 基因芯片检测方法具有较高的特异性,混合PCR可以分别按照种属内和种属间的引物组合方案用于多病原的筛检。该基因芯片检测可以采用3个引物体系完成样品标记。     

应用xMAP液念芯片多重快速检测四种病原微生物的研究

目的:建立一种多重、快速、特异性好、灵敏度高的病原微生物检测方法。方法:根据GenBank数据库中的小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生性李斯特菌、产气荚膜梭菌、鼠疫耶尔森氏菌基因序列,分别针对ail、hly、cpe、3a基因设计4对引物和4条探针。通过重叠PCR扩增各目的基因并构建重组质粒,以该重组质粒DNA为模板,通过多重PCR同时扩增上述4个基因,建立xMAP液态芯片检测技术,在此基础上对标准菌株基因组DNA进行检测并验证该方法的特异性和敏感性。结果:xMAP液态芯片对质粒DNA和标准菌株基因组DNA的检测结果与多重PCR结果一致。该方法能在3.5 h内同时完成对4种病原菌的检测,特异性好,且敏感性要高于PCR方法,灵敏度最高可达200CFU/ml。结论:xMAP液态芯片技术是病原微生物的多重快速检测的新方法,具有很好的应用价值和前景。     

应用xMAP液态芯片多重快速检测四种病原微生物的研究

目的：建立一种多重、快速、特异性好、灵敏度高的病原微生物检测方法。方法：根据GenBank数据库中的小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生性李斯特菌、产气荚膜梭菌、鼠疫耶尔森氏菌基因序列,分别针对ail、hly、cpe、3a基因设计4对引物和4条探针。通过重叠PCR扩增各目的基因并构建重组质粒,以该重组质粒DNA为模板,通过多重PCR同时扩增上述4个基因,建立xMAP液态芯片检测技术,在此基础上对标准菌株基因组DNA进行检测并验证该方法的特异性和敏感性。结果：xMAP液态芯片对质粒DNA和标准菌株基因组DNA的检测结果与多重PCR结果一致。该方法能在3.5 h内同时完成对4种病原菌的检测,特异性好,且敏感性要高于PCR方法,灵敏度最高可达200CFU/ml。结论：xMAP液态芯片技术是病原微生物的多重快速检测的新方法,具有很好的应用价值和前景。     

多功能悬浮点阵技术快速检测肠道致病菌的初步应用研究

目的建立以多功能悬浮点阵技术为基础的临床常见肠道致病菌的快速检测方法。方法以细菌16S rDNA基因保守区序列设计1对通用引物,采用不对称PCR扩增7种临床常见肠道致病菌标准菌株,多功能悬浮点阵技术对不同菌株的PCR产物进行检测以验证相应菌种探针的特异性,最后对48份粪便标本进行肠道致病菌高通量快速检测。结果 7种临床常见肠道致病标准菌株的不对称PCR得到了大量单链产物,其产物用多功能悬浮点阵技术的检测特异性为100%,48份粪便标本不对称PCR产物可与相应探针发生特异性结合,且在多功能悬浮点阵技术的相应检测信号大于阴性对照3倍以上,5种细菌的多功能悬浮点阵技术检测结果与培养鉴定结果符合率100%,48份标本PCR产物均与志贺菌属探针发生杂交反应(阳性率100%)。结论 16S rDNA可以作为细菌快速鉴定的靶序列,不对称PCR产物可以显著提高与悬浮芯片杂交检测的灵敏度,多功能悬浮点阵技术在鉴定细菌方面具有简单快速、高通量、高检出率等特点,可以作为细菌快速鉴定的一种新方法,但无法鉴别志贺菌属和大肠埃希菌属。     

悬浮芯片在核酸和蛋白质检测中的应用

悬浮芯片是近年来兴起的一种新型检测技术,不同于固相基因芯片,它整合了高分子化学、分子生物学、免疫学、激光检测、微流体、高速数字信号处理、计算机分析等方面的先进技术,能够对少量样本进行高通量的定性、定量检测。主要综述了悬浮芯片技术的基本原理,并概要介绍了其在核酸和蛋白质检测中的应用。悬浮芯片技术在核酸和蛋白质检测中有着显著的优点,如高通量、操作简便、重复性好、灵敏度高、线性范围宽等,不但可以广泛应用于科学研究领域,而且还将逐渐普及于临床诊断实验室,具有广阔的应用前景。     

应用多重标记引物增强寡核苷酸芯片的荧光信号强度

寡核苷酸芯片技术是一种高通量发掘和采集生物信息的强大技术平台,目前已广泛应用于生物科学领域 . 为改善寡核苷酸芯片的分析性能,对影响芯片杂交结果的因素,如片基表面的化学处理、探针的长度、间隔臂的长度、杂交条件等,进行了深入的研究和优化 . 对寡核苷酸芯片而言,仍有待解决的问题是如何产生更强的荧光信号来改善其检测灵敏度 . 利用两种类型的多个荧光分子标记的引物,来增强二维寡核苷酸芯片平面上的荧光信号强度 . 两种引物分别命名为：多标记线性引物和多标记分支引物 . 通过增加标记在目标 DNA 片段上的荧光分子数,可以显著增强寡核苷酸芯片上相应捕获探针的信号强度 . 实验表明,使用多标记引物能将所用的寡核苷酸微阵列的检测限 ( 以能够检测的最低模板量计算 ) 降低至单荧光标记引物的 1/100 以下,多重标记技术是一种有效增强微型化探针矩阵检测灵敏度的信号放大方法 .     

采用分子生物学技术诊断隐球菌脑膜脑炎的研究

目的采用分子检测技术对疑似隐球菌感染的脑膜炎病例进行诊断。方法收集患者的脑脊液样本,提取DNA,设计引物进行PCR扩增,采用DNA芯片技术对扩增产物进行分子检测。结果显示样本新生隐球菌阳性。结论通过ITS保守序列设计引物进行PCR扩增和DNA芯片技术对常规真菌学检查不能确定的疑似隐球菌脑膜炎患者脑脊液样本进行非培养检测,具有实验室诊断参考价值。     

大肠杆菌O157菌体抗原基因检测芯片的制备

选择编码O157菌体抗原特异合成酶的rfbE基因设计引物于口探针,并制备检测芯片,通过两次PCR扩增,制备荧光标记的靶序列,并与芯片进行杂交,检测O157菌株和非O157病原体。结果所有O157菌株均在芯片相应探针处出现阳性信号,非O157杂交结果均为阴性;芯片检测灵敏度比PCR检测高50倍。说明基因芯片可以快速、灵敏、特异地检测O157菌体抗原,为建立快速灵敏的检测细菌病原体特征和鉴别诊断的自动分析系统提供了新方法。