杆状病毒载体及其在昆虫细胞中表达外源基因的研究进展

本文介绍了杆状病毒载体在昆虫细胞中表达外源基因的基本策略和发展趋势。杆状病毒载体系统近年来已被人们广泛用来表达人类、动物和植物等的一些重要蛋白质分子,在医学、农业等领域的基因工程研究中发挥了越来越大的作用。杆状病毒载体系统表达外源基因的效率高,表达产物的结构和活性与天然产物一致,为当今基因工程研究中最有发展前途的病毒载体表达系统。     

酵母高效克隆表达T载体pYES2-T的构建及应用

为了在酵母中高通量、高效率地对外源基因进行克隆和表达,本研究以酵母表达载体pYES2为基础,构建高效克隆表达T载体。pYES2是酿酒酵母的一种高效表达载体,在其多克隆位点处设计插入XcmⅠ-Intron-XcmⅠ片段,同时将其载体中URA3基因中原有的XcmⅠ酶切位点进行定点突变,构建出pYES2-T酿酒酵母高效表达T载体。利用XcmⅠ酶切载体pYES2-T,使其产生两个突出的T末端,一方面可以通过PCR产物加A的方式直接进行TA克隆;另一方面可在半乳糖诱导启动子的调控下,对TA克隆后的外源基因在酵母中诱导表达。利用该系统高通量地对人工合成耐盐系列基因NLEAs进行筛选,研究结果表明,该系统可以在酿酒酵母中一步式完成片段克隆及耐盐基因的筛选。本研究构建的酵母表达T载体使用方便、效率高、成本低,应用前景广阔。     

植物基因工程表达载体的改进和优化策略

外源基因在转基因植物中表达效率低一直是令相关研究困扰的一个问题。转基因植物的生物安全性最近在全球范围内开始引起世人的担优。本简要介绍了近年来在植物表达载体构建方面所采用的一些新策略,这些策略有助于增强外源基因的表达水平,提高生物工程体的安全性。     

杆状病毒表达系统研究进展

介绍了杆状病毒表达系统的构建策略,载体发展情况及其表达外源基因的影响因素.杆状病毒表达系统在基因工程、药物开发、疫苗生产等方面发挥了越来越重要的作用,其表达效率高,表达产物与天然产物有相似的结构和活性,且对人畜无害,为当今基因工程研究中最有发展前途的表达系统.     

利用病毒载体在烟草中瞬时表达融合HBsAg基因

利用马铃薯PVX病毒载体构建了外源人工融合乙肝表面抗原HBsAg基因的表达载体,在烟草中利用农杆菌介导进行瞬时表达,以快速鉴定外源基因瞬时表达的状况以及重组蛋白的免疫活性。利用PCR技术从含有人工融合HBsAg基因的表达载体中分别扩增出LP PreS1 PreS2 S、PreS1 PreS2 S、PreS2 S序列,将其分别与PVX病毒载体pgR106连接,构建成PVX-LP、PVX-S1和PVX-S2等3个转化载体,并将此载体导入农杆菌菌株GV3101中用于侵染烟草植株叶片。感染植株经RT-PCR、RNA Dot blotting和HBsAg蛋白的ELISA检测显示,3个人工融合的HBsAg基因均可在植物体内得到转录,翻译成具有活性的蛋白。结果表明,外源融合HB-sAg基因经过植物病毒载体瞬时表达系统可以在植物系统中正常转录和翻译。     

植物病毒表达载体研究进展

利用ＤＮＡ或ＲＮＡ植物病毒作载体表达外源蛋白是几年发展较快的一种新的遗传转化方式,它具有以下几个优点,表达量大,表达速度快,地进行基因操作和接种以及适用对象广泛。已发展的四种载体构建策略包括：基因取代,基因插入,融合抗原和基因互补。植物病毒表达载体可以用于基因的重组、病毒的移动和基因功能的检测等基础性研究,也可用于商业上表达多种药用蛋白或疫苗,植物病毒表达载体的稳定性主要取决于存在同源序列而引起的     

植物遗传转化表达载体研究进展

植物遗传转化表达载体是植物转基因研究中非常重要的一个环节,外源基因在转基因植物中的高效表达是转基因研究成功的关键。综述了植物遗传转化表达载体近年来的研究进展情况,着重介绍了在转基因植物中实现外源基因高效表达的多种途径和策略,旨在提高转基因植物中外源基因的表达水平和生物安全性,并展望了今后植物转基因研究及商业化发展方向。     

外源基因在植物病毒表达载体中表达策略的研究进展

利用植物病毒表达载体表达外源蛋白是近年来发展起来的具有表达量大,速度快和廉价等优势的生产系统,其有4种构建策略;基因取代,基因插入,融合抗原和基因互补,此外还从病毒表达载体的基础性研究和商业应用方面进行了详细讨论。     

抗菌肽基因misgurin同向串连表达载体构建新策略

目的是将抗菌肽基因misgurin以同向串连方式连接成多拷贝基因,并克隆到甲醇酵母表达载体上。在设计和连接中采用新策略,运用常规分子克隆操作进行表达载体构建,结果表明,该策略能方便高效地进行基因多拷贝同向串连表达载体的构建。     

小肽多拷贝基因表达载体的构建及其高效表达(英文)

介绍一种快速、高效构建小肽多拷贝基因表达载体的策略 ,并构建了相应的表达载体pETE coT .用人工合成的编码 2 8个氨基酸残基的胸腺素α1基因为模型 ,采用限制酶EcoT14I识别序列CCAAGG为小肽基因两末端序列 ,利用其酶切后可产生非镜相对称粘性末端 ,一次连接反应就构建出一系列不同基因拷贝数的表达载体 ;在小肽基因两端分别引进编码FactorXa和羟胺蛋白切割位点的序列 ,表达出的融合蛋白可被FactorXa和羟胺剪切出不残留任何外源氨基酸的小肽 .不同拷贝数的小肽融合蛋白在大肠杆菌BL2 1(DE3)中均获得高效表达 .     

cmv-3’LTR嵌合启动子对逆转录病毒载体MFG滴度及外源基因表达的影响

为减轻逆转录病毒载体介导的外源基因的沉默,进一步提高逆转录病毒载体MFG介导的外源基因的表达水平,同时探讨逆转录病毒3’端长末端重复序列(long-terminal repeat,LTR)内U3区对病毒基因表达的影响,将逆转录病毒载体3’端LTR内的U3区用cmv核心增强子、启动子序列替代,同时去除了3个与逆转录病毒载体启动子甲基化有关的序列NCR、DR,并以egfp为报告基因,构建了MFG-egfp和MFG-egfp-cmv表达载体。结果显示：利用cmv启动子替代MFG载体3’端LTR的U3启动子序列,会显著降低MFG载体的病毒滴度及其介导的外源报告基因的表达。提示利用cmv启动子替代病毒载体的3’端LTR内的U3区,并不是提高MoMLV(moloney murineleukemi virus)逆转录病毒载体介导外源基因的表达及其病毒滴度的理想策略。结果也同时提示：在MoMLV逆转录病毒3’端LTR限的U3区,可能存在与病毒RNA加工、成熟及稳定性有关的信号序列。     

一种高效、稳定的分泌型原核表达载体的构建及应用

以本室构建的原核表达载体pTO-T7为基础载体,PCR合成ompT引导序列,插入该载体多克隆位点上游,构建了分泌型原核表达载体pTO—OT。将2个外源基因克隆至pTO—OT,2个重组质粒在大肠杆菌中均得以高效表达,表达量为25％～30％。Western印迹分析证实了重组蛋白在大肠杆菌中表达后可被信号肽酶有效识别,切割后的重组蛋白具有良好的免疫学活性。对重组表达菌株的连续传代实验证实了该表达载体具有良好的遗传稳定性,显示了该原核表达载体在基因工程中的应用价值。     

大肠杆菌外源蛋白表达载体稳定性的研究进展

构建高产、稳定、可靠的质粒载体成为基因重组表达技术的研究重点之一。宿主细胞代谢反应和质粒不稳定性相关信息的缺乏,仍然阻碍着质粒载体的优化,成为限制外源蛋白在大肠杆菌中高效表达的瓶颈之一。主要论述了大肠杆菌外源蛋白表达载体的稳定性,分别从质粒和外源基因的本身特性、重组质粒转化对宿主细胞造成的影响及其他因素等方面阐述了对质粒载体稳定性的影响,同时介绍了相关的解决办法,从而为大肠杆菌表达系统高效表达外源蛋白提供参考。     

大肠杆菌多基因共表达策略

利用基因工程手段实现多个基因在同一宿主菌中共表达是大肠杆菌细胞发育调节研究和代谢途径改造的有效手段。介绍了单一转录单元的多基因共表达载体、多重转录单元的多基因共表达和单基因载体的构建原理、特点、优势及转化策略,并着重介绍了利用LIC衔接子实现基因在多基因载体上定位连接的原理和方法。     

基于BAC重组酶系统构建莱航鸡多位点基因打靶载体的研究

以莱航鸡重复的rDNA基因间的间隔序列为靶位点,利用BAC重组酶系统构建含人干扰素基因的多位点基因打靶载体,为建立莱航鸡多位点基因打靶技术获得关键材料。首先构建BAC-TDN筛选载体,然后构建pYLVS-GID表达载体。将BAC—TDN筛选我体和pYLVS-GID表达我体共转化至大肠杆菌NS3529中,通过其Cre重组酶的作用形成BAC-TDN-VS-GID质粒,采用归位内切酶I-SeeⅠ切除pYLVS质粒骨架,利用接头塔使之环化,构建成莱航鸡大容量多位点基因打靶载体BAC-TDN—GID。每次克隆均经酶切或PCR、测序等鉴定DNA片段的插入及插入方向。以该载体为材料的多位点基因打靶技术将提高基因定点整合效率,解决外源基因不能稳定表达、安全性等部分问题,突破了DNA重复序列不能作为外源基因整合靶位点的禁区。     

基于DNA和RNA的双功能Semliki森林病毒复制子载体的构建

以semliki森林病毒衍生的复制子载体pSFV1和辅助载体pSFV-helper2为骨架, 用CMV IE和T7启动子替换SP6启动子并在3′ UTR下游插入BGH转录终止子,构建了基于DNA和RNA的复制子表达载体pSMCTA和辅助载体pSHCTA。在DNA和RNA二种递送方式上证实该表达载体可高水平表达外源基因,与辅助载体共转染可制备具有感染能力并能表达外源基因的重组病毒颗粒。构建的基于DNA和RNA的双功能复制子载体显著地提高SFV载体应用范围,在体外可用于高水平表达外源基因及大规模制备重组病毒颗粒,在体内也可用于研制复制子疫苗和基因治疗载体。     

植物病毒表达载体研究进展

利用DNA或RNA植物病毒作载体表达外源蛋白是近几年发展较快的一种新的遗传转化方式,它具有以下几个优点:表达量大,表达速度快,易于进行基因操作和接种以及适用对象广泛。已发展的四种载体构建策略包括:基因取代,基因插入,融合抗原和基因互补。植物病毒表达载体可以用于基因的重组、病毒的移动和基因功能的检测等基础性研究,也可用于商业上表达多种药用蛋白或疫苗。植物病毒表达载体的稳定性主要取决于存在同源序列而引起的基因重组。本文还对病毒载体的生物安全性进行了讨论。     

基于BAC重组酶系统构建莱航鸡多位点基因打靶载体的研究

以莱航鸡重复的rDNA基因间的间隔序列为靶位点,利用BAC重组酶系统构建含人干扰素基因的多位点基因打靶载体,为建立莱航鸡多位点基因打靶技术获得关键材料。首先构建BAC-TDN筛选载体,然后构建pYLVS-GID表达载体。将BAC-TDN筛选载体和pYLVS-GID表达载体共转化至大肠杆菌NS3529中,通过其Cre重组酶的作用形成BAC-TDN-VS-GID质粒,采用归位内切酶I-SceⅠ切除pYLVS质粒骨架,利用接头LS使之环化,构建成莱航鸡大容量多位点基因打靶载体BAC-TDN-GID。每次克隆均经酶切或PCR、测序等鉴定DNA片段的插入及插入方向。以该载体为材料的多位点基因打靶技术将提高基因定点整合效率,解决外源基因不能稳定表达、安全性等部分问题,突破了DNA重复序列不能作为外源基因整合靶位点的禁区。     

获得多价转基因作物的策略

本探讨了在利用植物基因工程技术的基础上,通过构建多基因或多个表达载体,进行一次,多次基因转化或共转化方法获得转多价基因作物的一些策略,并进行了展望。     

痘苗病毒载体在病毒疫苗研制上的应用

痘苗病毒作为真核表达载体已广泛应用于外源基因的表达,并日益受到重视,本文就痘苗病毒的生物学特性,重组痘苗病毒的构建原则,外源基因在重组痘苗病毒中的表达情况及重组痘苗病毒作为活疫苗的优缺点等方面作一概括性综述。