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1.
曾星 《中国生物化学与分子生物学报》1997,13(4):385-390
在克隆了人基因组全长vigilin基因的基础上,对其5端转录调控区域再克隆,获得Vig-CG5-7E克隆,再用限制酶ApaⅠ和EcoRⅠ切除3端约4kb部分,得到Vig-CG5-7E3AE克隆,并对该克隆进行双向测序分析.结果表明:克隆Vig-CG5-7E用ApaⅠ酶消化后,用cDNA上游开始的20个碱基组成的寡聚核苷酸做探针进行分子杂交,可见一条小于0.1kb杂交带,根据物理图谱分析,位于Vig-CG5-7E3AE克隆的ApaⅠ端,从而推断该克隆含有转录调控元件,5端序列分析得到二个TATA盒,一个CAAT盒和一个GC盒以及二个可能的Ap-1和Ap-2结合位点.认为GC盒可能为人vigilin基因启动子的组成部分 相似文献
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为研究小鼠低密度脂蛋白(LDL)受体相关蛋白5(LRP5)基因5′端调控序列的功能,PCR扩增小鼠Lrp5基因翻译起始位点上游3041bp(-2909bp~ 132bp)DNA序列.PCR产物定向克隆到pGL3-basic载体上,重组质粒命名为pGL3-2909.以pGL3-2909质粒为模板,以不同的引物扩增出不同长短的DNA片段,分别定向克隆到含小鼠Lrp5基因基本启动子并含有荧光素酶报道基因的pGL3-103载体上,构建了12种荧光素酶报告基因表达体系:pGL3-267,pGL3-513,pGL3-535,pGL3-560,pGL3-575,pGL3-623,pGL3-645,pGL3-719,pGL3-770,pGL3-1032,pGL3-1330,pGL3-1619.以pRL-TK为内参照质粒,瞬时转染COS-7细胞,48h后收集细胞测定荧光素酶相对表达活性,pGL3-575(-2909bp~-2334bp)活性是pGL3-513(-2909bp~-2396bp)的20%,pGL3-535(-2909bp~-2374bp)的活性是pGL3-513的44%,pGL3-575的活性是pGL3-560(-2909bp~-2349bp)的48%,均有显著性差异.结果表明,在-2396bp与-2374bp之间的22bp区域内以及-2349bp与-2334bp之间的15bp区域内存在负调控元件.软件分析表明,此区域含有IK2,LYF1及MZF1调控元件. 相似文献
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为研究小鼠低密度脂蛋白(LDL)受体相关蛋白5(LRP5)基因5′端调控序列的功能,PCR扩增小鼠Lrp5基因翻译起始位点上游3041bp(-2909bp~+132bp)DNA序列.PCR产物定向克隆到pGL3-basic载体上,重组质粒命名为pGL3-2909.以pGL3-2909质粒为模板,以不同的引物扩增出不同长短的DNA片段,分别定向克隆到含小鼠Lrp5基因基本启动子并含有荧光素酶报道基因的pGL3-103载体上,构建了12种荧光素酶报告基因表达体系:pGL3-267,pGL3-513,pGL3-535,pGL3-560,pGL3-575,pGL3-623,pGL3-645,pGL3-719,pGL3-770,pGL3-1032,pGL3-1330,pGL3-1619.以pRL-TK为内参照质粒,瞬时转染COS-7细胞,48h后收集细胞测定荧光素酶相对表达活性,pGL3-575(-2909bp~-2334bp)活性是pGL3-513(-2909bp~-2396bp)的20%,pGL3-535(-2909bp~-2374bp)的活性是pGL3-513的44%,pGL3-575的活性是pGL3-560(-2909bp~-2349bp)的48%,均有显著性差异.结果表明,在-2396bp与-2374bp之间的22bp区域内以及-2349bp与-2334bp之间的15bp区域内存在负调控元件.软件分析表明,此区域含有IK2,LYF1及MZF1调控元件. 相似文献
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马铃薯GBSS基因5‘侧翼区调控作用的研究 总被引:4,自引:0,他引:4
将0.4、0.8、1.6、2.9kbGBSS基因的5'侧翼区与GUS基因融合,构建了双元表达载体。0.8kbGBSS-GUS通过基因枪介导在块茎切片中获得了瞬间表达。以上建构物通过农杆菌介导转入了马铃薯。X-Gluc染色及PCR结果证实已获得转基因植株。利用离体块茎诱导系统,GUS表达用荧光进行定量检测,结果显示,2.9、1.6、0.4kbGBSS-GUS的表达均以块茎明显高于茎段,达2 ̄10倍。 相似文献
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hhlim基因转录调控区域鉴定及表达调控的初步研究 总被引:2,自引:2,他引:2
为了研究hhlim基因表达调控机制,对该基因5′上游-2 537 bp序列从5′端依次进行缺失后,利用荧光素酶报告基因检测各种不同长度片段在C2C12细胞中驱动荧光素酶表达的活性.结果表明,在hhlim基因5′上游-2 537~-1 537 bp之间存在负调控元件,在-253~-157 bp之间含有增强子样序列.用含有增强子样序列的DNA片段做探针,对未分化型和分化型C2C12细胞的核蛋白进行电泳迁移率改变分析(electrophoretic mopility shift assay, EMSA).分析的结果显示,两种表型细胞中的核蛋白与探针结合所形成滞后带的谱型明显不同.结果还发现内皮素-1(ET-1)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)既能显著诱导C2C12细胞对hhlim的表达,也能刺激含增强子样序列的调控区域所驱动的报告基因表达.提示hhlim基因转录起始点至-2 537 bp的区域内含有负调控元件及增强子样序列,该基因的表达受ET-1和bFGF的调节. 相似文献
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西瓜果实特异性基因wml1的5‘端上游调控序列的分离 总被引:2,自引:0,他引:2
西瓜(Citrullus vulgris Schrad.)ADP-葡萄糖焦磷酸化酶大亚基基因wml1的表达具有果实特异性。本文利用Uneven PCR技术成功地从西瓜基因组DNA中分离出一段长1864bp、位于wml1基因5‘端上游的新序列。该序列含有TATA盒和CAAT盒,具典型的启动子特征。克隆序列中180bp-1752bp和958bp-1752bp两个片段分别与GUS基因融合进行瞬间表达试验,结果初步表明180bp-1752bp片段具有果实特异性启动子活性,转录调控元件位于序列的180bp-958bp。 相似文献
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人干细胞因子(human stem cell factor,hSCF)是一个多功能细胞生长因子,调节某些哺乳动物干细胞如原始胚细胞的增殖、分化和移居。为研究hSCF基因的转录调控机理,对hSCF基因5’旁侧序列不同长度片段进行亚克隆,构建系列重组pGL2荧光素酶报告基因载体,转染人乳腺癌细胞株MCF并检测luc基因一过性表达活性。然后应用电泳迁移率变动分析技术,鉴定活性片段与MCF细胞核抽提蛋白质 相似文献
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HMG蛋白质是一类在染色质内含量极为丰富的非组蛋白质,它们在染色质的结构与功能中起着重要的作用。本文运用凝胶电泳阻抑法和DNaseI足迹法分析了HMG蛋白质与人ε-珠蛋白基因5'旁侧调控元件DNA之间相互作用的情况。结果表明HMG蛋白质(1/2)既能与两个正调控元件(-535 ̄-453bp和-446 ̄-419bp)DNA相结合,也能与启动子(-177 ̄+1bp)DNA相结合;而HMG蛋白质(14/ 相似文献
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人β—簇珠蛋白基因LCR调控元件中HS3与反式调控因子相互作用的研究 总被引:1,自引:0,他引:1
Upstream of the human epsilon-globin gene is the Locus Control Region (LCR) of the human beta-globin cluster, which consists of four DNase-I hypersensitive sites(HS1-HS4). It has been reported in transgenic experiments that HS3 preferentially regulates epsilon-globin gene expression. In order to elucidate the regulatory function of HS3 in the expression of globin gene, nuclear extracts from mouse hematopoietic tissues at several developmental stages were prepared and the binding of the nuclear factors to HS3 was analysed by using electrophoresis mobility shift assay(EMSA). Our results showed that the binding patterns of HS3 with nuclear extracts of mouse hematopoietic tissues at day 13 and day 18 of gestation were completely different; furthermore, by Southwestern Blot, the distinction between both stages was also demonstrated. It has been known that GATA and CACCC binding motifs are contained within HS3 core region. Using competitive gel-retardation assay, we found that no shift bands could be competed by using CACCC motif as a competitor. However one shift band at day 13 and day 18 of gestation could be competed respectively by using GATA motif as a competitor. We suggested that the shift bands, which could not be competed by both motifs, might be novel and stage-specific factors. In addition, by using Western Blot, we demonstrated that the two shift bands at day 13 and day 18 of gestation, competed by GATA motif, were GATA-2 and GATA-1 respectively: GATA-1 was expressed in mouse hematopoietic tissues at day 18 of gestation and not expressed at day 13 of gestation; however, GATA-2 was only expressed in mouse hematopoietic tissues at day 13 of gestation. According to these results, we speculated that HS3 might play an important role in regulation of stage-specific expression of globin genes through interaction between stage-specific nuclear factors and HS3. 相似文献
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鸡生长激素基因5‘端部分调控区的克隆分析 总被引:7,自引:0,他引:7
利用PCR技术扩增、克隆、测序了7个跨越不同生长速度的鸡品种(系)的生长激素(GH)基因的5'端部分调控区。这7个品种(系)分别为:高生长速度的宝罗肉鸡父本;较高生长速度和一定的产蛋性能的宝罗肉鸡母本;肉蛋灵用型的芦花鸡;中等生长速度和中等体重的蛋鸡品种洛岛红和农大褐;生长速度较慢体重较轻的蛋鸡品种北京白鸡和生长速度很慢但又不是矮小型的地方品种丝毛乌骨鸡。所扩增的片段长度为760bp,包括了转录起 相似文献
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淋巴毒素(Lymphotoxin,LT)是由活化的T淋巴细胞分泌的一种糖蛋白。LT基因的表达调控主要是在转录水平上。PHA+PMA诱导的Jurkat细胞总RNA点渍杂交发现,Jurkat细胞的内源性LTmRNA的数量随诱导时间的延长而增加。凝胶迟滞电泳分析发现,PHA+PMA诱导4小时的Jurkat细胞核抽提物形成多种复合物,且在诱导不同时间后有明显变化。系列缺失片段的竞争反应表明,这些复合物的形成与LT基因5'端上游──128bp──93bp左右的序列相关。DNasel足迹法及其竞争实验发现,LT基因5'端上游─—104bp──83bp(共22bp)序列具有明显的蛋白质保护足迹。同源性分析发现此22bp的序列中存在一个KB样结合位点:─100bp──90bp(5’-GGGGGCTTCCC-3’)。NP-KB类蛋白质因子参与了此序列的DNA-蛋白质的特异性结合,可能存在多种类型的NP-KB类蛋白因子参与了LT基因的表达调控。 相似文献
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在遗传学家、分子生物学家与胚胎学家携起手来,共同研究发育生物学的基本问题后,人们对于发育的遗传控制的认识有了长足的进步。80年代在果蝇(Drosophila melanogaster)中取得的一系列进展,如控制前后体节形成的一套完整基因系统的发现,同源异形突变(如双胸突变)基因的克隆,同源盒基因被证实在从线虫到人类的发育控制中均起重要作用,等等,使人们对于发育过程的基因控制有了这样的认识轮廓:每一种具体的发育过程主要 相似文献
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人β-珠蛋白基因主要在成年期的骨髓中表达,在胎儿肝,成年肟和K562细胞中则处于关闭状态,凝胶电泳阻抑法分析发现,在人和肝,成年肝及K562细胞的核蛋白抽提物中存在着不同的与β-珠蛋白基因5旁侧调控元件(-372到-194bp)相结合的红系组织特生的调控因子。竞争试验的结果表明,成年肝和K562细胞中的调控因子与β-珠蛋白基因5旁侧调控元件相互作用的方式具有一定的相惟性,这两各细胞的调控因子既结合 相似文献
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Xmyf-5是爪蟾胚胎肌细胞决定的关键基因之一,研究Xmyf-5的表达调控有助于揭示肌肉原基的形成和肌肉发育的分子机制。从爪蟾部分基因组文库筛选到Xmyf-55‘上游4.9kb片段。该片段指导报告基因在爪蟾胚胎内的表达以及其缺失片段指导的报告基因活性分析结果显示,Xm6sf-55’上游4.9kb片段内含有指导Xnyf-5在胚胎内的表达以及其缺失片段指导的报告基因活性分析结果显示,Xmyf-55‘ 相似文献
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牛β-酪蛋白5′端上游调控序列的克隆和序列分析 总被引:3,自引:0,他引:3
该文用PCR扩增了牛β-酪蛋白基因5′-端上游调控序列,并对其进行了克隆和序列分析。采集成年母牛肝,提取DNA。在牛β-酪蛋白基因外显子1和上游调控区内设计引物,扩增其上游调控序列。两条引物长均为19个核苷酸,引物间跨度为635bp。以牛肝DNA为模板,进行PCR扩增,扩增产物在2%琼脂糖凝胶上电泳,可见特异的目的条带。从凝胶中回收目的片段,克隆到pGEM-T载体中。重组质粒提取DNA,进行序列分析。测序结果与文献发表的类似序列相比,仅有4个碱基不同,同源性达99.4%。表明获得了牛β-酪蛋白基因5′-端上游调控序列的克隆。 相似文献