美洲拟鲽抗冻蛋白基因(afp)导入番茄的研究

将整合在Ｔｉ质粒上的ａｆｐ基因作为供体ＤＮＡ,用花粉管通道和子房注射方法导入番茄品种“中蔬四号”中,对Ｄ１、Ｄ２代进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交获得杂交带;田间抗寒性试验表明,在春季平均气温低于正常年份４·４℃条件下,转基因组植株生长势优于对照;致死温度也比对照降低２℃．说明ａｆｐ基因已整合到转化番茄基因组并获得表达     

转美洲拟鲽抗冻蛋白基因（AFP）番茄的叶片电导率测定

对转美州拟鲽抗冻蛋白基因（ＡＦＰ）的第三代（Ｄ３）番茄及其对照,经低温处理后进行幼苗叶片组织电导率测定,发现转基因各组电导率均比对照明显降低,说明导入的ＡＦＰ基因已经表达并使番茄获得抗寒性。     

转美州拟鲽抗冻蛋白基因(AFP)番茄的叶片电导率测定

对转美州拟鲽抗冻蛋白基因（ADP）的第三代（D3）番茄及其对照,经低温处理后进行幼苗叶片组织电导率测定,发现转基因各组电导率均比对照明显降低,说明导入的AFP基因已经表达并使番茄获得抗寒性。     

用美洲拟鲽抗冻蛋白基因转化植物的问题

评估了我们用美洲拟鲽抗冻蛋白基因转化烟草和国内有人用同一基因转化蕃茄的研究,提出植物耐寒性状的提高与转基因植物中抗冻蛋白含量呈正相关是转基因植物成功的关键性指标。同时,美洲拟鲽抗冻蛋白的空间结构与冷诱导蛋白相似而且都保护细胞膜免受冻害,因而提出了用冷诱导蛋白调节元的顺式作用元件和反式作用因子的调控序列来控制抗冻蛋白基因在植物中冷诱导表达的思路。     

美洲拟鲽抗冻蛋白基因转化番茄的形态学与苹果酸脱氢酶同工酶检测

将带有afp基因的Ti质粒pMon(232),作为供体DNA,用花柱道和子房注射DNA的方法转化番茄品种“中蔬四号”对D1D2代进行田间抗寒性观察,发现在春季平均气温低于正常年分4．4℃条件下,有些组分田间长势明显好于对照。初步确认已获得抗寒性。对D2代转基因植株进行MDH同工酶分析,均与对照有明显差异,间接验证了外源DNA的导入,说明同工酶分析,可作为转基因植株早期筛选的生化指标。     

美洲鲽抗冻蛋白基因的克隆及在E.coli中的表达

本文报告了美洲鲽抗冻蛋白基因的克隆及在E.coli中表达的研究,以质粒P~(CT5)作为抗冻蛋白基因的供体,p~(ORF-2)作为表达载体。用HpaⅡ酶从质粒p~(CT5)上切下抗冻蛋白基因片段,再经Bal 31酶,绿豆核酸酶处理,连接上BglⅡ接头,然后插入到p~(ORF-2)的BglⅡ位点上,借助于p~(ORF-2)上的β-半乳糖苷酶基因的活性,使含正确插入抗冻蛋白基因的克隆呈现出蓝色菌落,共获得4000多个转化子,其中有201个蓝色克隆。对于50个蓝色克隆提取质粒DNA,电泳后发现均大于p~(ORF-2)。用BglⅡ消化后,可以发现有300—1500bpDNA片段,同时确定了抗冻蛋白基因在p~(ORF-2)中的插入方向,对于正确插入的克隆作出部分限制性内切酶图谱,测定出插入的抗冻蛋白基因片段的DNA序列,然后将重组质粒从E.coli MH1000菌株转化到E.coliTK1046中,研究分析表达产物,SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳结果证明插入的抗冻蛋白的基因已表达,有明显的融合蛋白带,分子量大于β-半乳糖苷酶、是由大肠杆菌的外膜蛋白F,抗冻蛋白和β-半乳糖苷酶组成。融合蛋白含量占总蛋白的20％左右。     

美洲鲽抗冻蛋白基因的亚克隆及构建转基因鱼的表达载体

用限制性内切酶Ｐｓｔ Ｉ部分消解含有美洲鲽抗冻蛋白基因的ｐＣＴ５质粒,分离得到３２４ｂｐ的片段,将此片段亚克隆到ｐＵＣ１９质粒中,筛选到ｐＵＣ－ＡＦ重组子。从ｐＵＣ－ＡＦ重组子中,用ＢａｍＨＩ和ＨｉｒｄⅢ切下３２４ｂｐ的抗冻蛋白基因,再重组到含有ＳＶ４０病毒启动子的ｐＫＳＶ－１０的载体中,构建成转基因鱼的表达载体,此表达载何可用于鱼的基因转移的研究。     

美洲拟鲽抗冻肽基因在E.coli中的表达

动物抗冻肽（ＡＦＰ）以降低动物体液冰点而使其能在寒冷的环境中生活,因而ＡＦＰ在防寒抗冻方面有较大的潜力。根据美洲拟鲽ＡＦＰ基因的ｃＤＮＡ序列,人工合成了ＡＦＰ及春含前导序列的ｐｒｏＡＦＰ的ｃＤＮＡ,并构建成ＰＡＦＰ及ＰＰＡＦＰ原核表达载体。由于ＡＦＰ表达量少且蛋白分子很小,用ＳＤＳ－蛋白电泳难以检测。为了提高检测的灵敏度,把报道基因ＣＡＴ的ＣＤＮＡ按读码框连接到ＡＦＰ的３＇末端,构建成融合基因表达     

美洲拟蝶抗冻蛋白基因在E. Coii中表达的研究”

y.文阐述了美洲拟蝶抗冻蛋白基因在E. coli中表达的研究。用Hpa II酶切pCT5质片价晰 出抗冻蛋白基因片段,再经Bal引酶、绿豆核酸酶处理,井连接＿｛：Bgl 11接头,插人到、>RF-2龙达嘴 粒的B川II位点上,筛选出正确插入方向的转化子,称pORF-AF。并对pORF-AF质粒作昌部分限制 性酶切图谱,测定出插入基因的DNA序列,同时用SDS-聚丙烯队胺凝胶电泳分析检测插人基因,在 E. coli TK1046中的表达产物,发现布电泳图谱上有明显的融合蛋白带,分子是大于标准蛋i 一半乳 糖普酶是由大肠杆菌外膜蛋白F、抗冻蛋白和0-半乳糖营酶组成。融合蛋白含量占粉,的菌体提取蛋 白20％ 左右。     

用美洲拟鲽抗冻蛋白基因转化植物的问题

评估了我们用美洲拟鲽抗冻蛋白基因转化烟草和国内有人用同一基因转化蕃茄的研究 ,提出植物耐寒性状的提高与转基因植物中抗冻蛋白含量呈正相关是转基因植物成功的关键性指标。同时 ,美洲拟鲽抗冻蛋白的空间结构与冷诱导蛋白相似而且都保护细胞膜免受冻害 ,因而提出了用冷诱导蛋白调节元的顺式作用元件和反式作用因子的调控序列来控制抗冻蛋白基因在植物中冷诱导表达的思路。     

鱼类抗冻蛋白的研究 Ⅰ.黄盖鲽血清抗冻蛋白的特性及分离

本文首次报道了中国沿海鱼类中有含抗冻蛋白的鱼种存在。从产于中国黄海的黄盖鲽血清中分离提纯了抗冻蛋白,并对其进行了研究分析。黄盖鲽抗冻蛋白具有十分明显的降低血液冰点的作用,存在特征性的热滞现象。该蛋白的分子量为4500道尔顿左右,经Sephsdex G-25柱层析及高效液相色谱逆向层析法二步提纯。氨基酸组成分析结果表明它含有60％左右的丙氨酸。抗冻蛋白产生于黄盖鲽的冬季血清中,而不存在于夏季血清中。从肝脏中提取mRNA。Northern杂交证实,黄盖鲽抗冻蛋白是一类在转录水平上受到调控的蛋白。该蛋白的提纯及对其特性的研究,对研究抗冻基因的克隆及表达都具有重要的意义。     

抗冻蛋白基因结构与基因工程

鱼类抗冻蛋白有四种类型。Ⅰ型抗冻蛋白(AFP),富丙氨酸,如北美黄盖鲽AFP(Davies等1985,Scott等1985),Ⅱ型,富半胱氨酸,如海渡鸦AFP(Hayes等1989);     

抗冻蛋白结构基因片段的克隆

为了研究和开发利用抗冻蛋白或多肽,木文通过聚合酶链式反应（ＰＣＲ）合成了抗冻蛋白１１０ｂｐ的结构基因片段,然后将该基因片段克隆到大肠杆菌质粒载体Ｐ（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）Ⅱｋｓ＋／－上,获得了重组质粒,经酶切证明,获得的重组质粒中含有抗冻蛋白结构基因片段,以供该基因在大肠杆菌或酵母中表达抗冻蛋白。     

低温对转抗冻蛋白基因罗非鱼影响的初步研究

本文阐述了逐渐降低水温对转抗冻蛋白基因罗非鱼生存影响的初步观察结果。用３０尾转抗冻蛋白基因罗非鱼,从２２℃开始,以２℃／ｈ下降至７℃,发现在９℃有６尾死亡,７℃又有１０尾死亡,有１４尾存活,但有不同表现,从存活１４尾鱼和死亡的６尾鱼中提取总ＤＮＡ,作原位杂交,有１０尾为阳性,再从这１０尾呈阳性鱼肝中分离总ＲＮＡ,作ＲＮＡ—ＤＮＡ杂交并未发现阳性结果,表明有外源ＤＮＡ的整合,但未发生转录或弱的转录,不过有部分转基因鱼表现出具有耐低温能力。     

鱼类抗冻蛋白的研究——Ⅱ.黄盖鲽抗冻蛋白基因cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达

产于我国黄海的黄盖鲽(Pseudopleuronectes yokohamae)体内含有能阻止血液冰冻的抗冻肽(Antifreeze peptide AFP)。在对该蛋白进行纯化及对其特性的一系列研究的基础上,我们合成了一段抗冻肽基因的寡核苷酸片段。以此为引物,与黄盖鲽的mRNA进行杂交,从而特异性地反转录出抗冻肽基因cDNA片段。该片段经EcoRI Linker连接法克隆至大肠杆菌(E.coli)质粒载体pUC19上。抗冻肽cDNA插入片段经杂交证实后,对其进行了酶谱分析,核酸序列测定。重组克隆还在大肠杆菌JM83中得到了表达。     

几种拟除虫菊酯类杀虫剂对美洲斑潜蝇的防治效果

测定了拟除虫菊酯类农药功夫、灭扫利、速灭杀丁和兴棉宝对美洲斑潜蝇各龄幼虫、雌成虫的毒力以及对成虫取食、产卵的影响,并进行了田间小区试验。结果表明：美洲斑潜蝇一、二、三龄幼虫和雌成虫对功夫最敏感,一、二、三龄幼虫对功夫的 ＬＣ５０分别是 ０．００７５、０．００９３、０．０１１２ ｇ（ａ．ｉ．）／Ｌ,雌成虫对功夫的 ２４小时、４８小时的 ＬＣ５０分别是０．００２７、０．００２５ ｇ（ａ．ｉ．）／Ｌ。功夫对美洲斑潜蝇的取食、产卵拒避持效期分别是 ４天和 ６天,用浓度 ０．０２５ ｇ（ａ．ｉ．）／Ｌ的功夫药液处理 ０、２、４、６天后接虫,幼虫存活率分别是０、６．３％、６．８％和 ６１．６％,田间用浓度 ０．０２５、０．０１６７ ｇ（ａ．ｉ．）／Ｌ功夫分别处理,６天的校正虫口减退率分别是９１．９６％和８３．６０％。