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相似文献
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1.
T7启动子具有真核生物聚合酶Ⅱ顺式作用因子的功能   总被引:1,自引:0,他引:1  
根据a-鹅膏蕈碱(a-amanitin)对真核生物RNA聚合酶的选择性抑制,以氯霉素乙酰转 移酶基因(CAT)作为报道基因进行体内表达实验,证明T7噬菌体启动子可为真核生物RNA 聚合酶Ⅱ所启动。应用建立的竞争性DNA-蛋白质凝胶泳动技术,分别以TATA框、CAAT 框、GC框和八核苷酸序列(octamer)为竞争性寡核苷酸分子,发现人工合成的T7启动子可能 与 TFⅡD起始转录因子结合,形成 DNA-核蛋白质结合物。将 TATA框和八核苷酸序列分别 接入T7启动子上游,CAT实验显示八核苷酸序列可以增强RNA聚合酶Ⅱ对T7启动子的转录 起始作用。实验结果表明T7启动子可作为RNA聚合酶Ⅱ的顺式作用因子。  相似文献   

2.
周天鸿  王彤歌 《遗传学报》2000,27(5):455-461
根据α-鹅膏蕈碱(α-amaintin)对真核生物RNA聚合酶的选择性抑制,以氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)作为报道进行体内表达实验,证明T7噬菌体启动子可为真核生物RNA聚合酶Ⅱ所启动。应用建立的竞争性DNA-蛋白质凝胶泳动技术,分别以TATA框、CAAT框、GC框和八核苷权序列(octamer)为竞争性寡核苷酸分子,发现人工合成的T7启动子可能与TFⅡD起始转录因子结合,形成DNA-核蛋白质结  相似文献   

3.
将Mn-SOD与抗癌胚抗原(CEA)单链抗体基因(Sc-Fv gene)融合,重组到含T7启动子的表达载体pET-22b(+)中,构建表达质粒pETMn-SOD-ScFv,并转化大肠杆菌BL21(DE3),进行高效表达,表达物占菌体可溶性总蛋白的24%。SDS-PAGE和蛋白质和迹图谱显示表达物分子量为45kD与融合基因编码蛋白质的理论值相符。该蛋白质在大肠杆菌中为泌型表达有利于纯化。RIA测定表  相似文献   

4.
设计一对PCR引物,其中上游引物的5’端除目的基因外,还加T7RNA聚合酶启动子序列,以质粒(pSVLD3)为模板,通过PCR扩增出带有T7RNA聚合酶启动子序列的139bp的cDNA片段,它含有丁型肝炎病毒(HDV)基因组RNA中核酶(Ribozyme)区的cDNA该核酶具有自身裂解功能,经测序发现该cDNA有2个碱基变异,以此PCR产物为模板,通过T7RNA聚合酶,转录出核酶的前体,并观察到其  相似文献   

5.
腺病毒载体介导的肝癌细胞专一性自杀基因表达   总被引:5,自引:0,他引:5  
构建由肝癌细胞专一的afp基因表达调节元件控制自杀基因HSV-tk的穿梭质粒,将它与缺陷型腺病毒载体重组,得到AdrAFPTK病毒。经PCR及Southern杂交等证实它们含afp元件和tk基因。空斑形成试验表明病毒效价达1×1015pfu/L。同时构建由CMV启动子控制tk基因的类似载体作为对照。将这两个重组腺病毒分别感染AFP阳性(HepG2)或阴性(HeLa,BRL-3A)细胞株(m.o.i.=100),以丙氧鸟苷(ganciclovir,GCV)处理后,用MTT法测定杀伤细胞的效应。结果,AdCMVTK感染这三种细胞后,GCV半杀伤浓度分别为1.3、2、<1μmol/L;但是,AdrAFPTK感染的HeLa和BRL-3A细胞的GCV半杀伤浓度都>1000μmol/L,而对HepG2细胞只有<1μmol/L,表现出极高的细胞专一性。重组腺病毒AdrAFPTK可望用于肝癌的专一性基因治疗  相似文献   

6.
苜蓿根瘤菌(Rhizobiummeliloti)nodC蛋白是结瘤基因nodC编码的43kD多肽(NodC)。应用噬菌体T7RNA聚合酶/启动子表达系统.pT7-5作为载体质粒.构建了带有nodC基因的PBF6克隆.经诱导在大肠杆菌JAKE中获得表达,过量生成NodC,占细胞总蛋白量的5%。经细胞膜蛋白组份的分离,Bio-gel柱层析,SDS-PAGE电泳等获得了比较纯化的NodC。  相似文献   

7.
叶萍  李燕 《病毒学报》1998,14(3):215-220
将Epstein-Barr病毒(EBV)膜抗原(MA)BLLF1基因,插入含有CMV启动子的真核表达载体pcDNA3下游BamHI位点,构建成真核表达质粒pcDNA3-MA。将纯化的DNA注射Balb/c小鼠股四头肌。经免疫的动物产生抗EB病毒MA特异性的抗体和中和抗体,依赖抗体细胞介导的细胞毒作用(ADCC),特异性T淋巴细胞增生性反应及细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤作用。基因免疫与基因-蛋白  相似文献   

8.
T7启动子在哺乳类动物细胞中启动外源基因表达的研究   总被引:2,自引:0,他引:2  
人低密度脂蛋白(LDL)受体基因cDNA和氯霉素已酞转移酶基因(CAT)及PolyA信号序列被克隆进pGEM4载体的T7噬茵体启动子下游,构建成质粒pT7LDLR和pT7CAT.两个重组质粒转化CHO细胞.PCR和CAT酶实验显示:两个基因被T7噬菌体启动子所启动.结果证实真核生物RNA聚合酶能够识别T7启动子,转录外源基因.常用的含有T7启动子的质粒可同时作为原核生物和真核生物的表达载体.  相似文献   

9.
Epstein-Barr病毒膜抗原基因免疫的研究   总被引:4,自引:0,他引:4  
叶萍  李燕  谷淑燕 《病毒学报》1998,14(3):215-220
将Epstein-Bar病毒(EBV)膜抗原(MA)BLLF1基因,插入含有CMV启动子的真核表达载体pcDNA3下游BamHI位点,构建成真核表达质粒pcDNA3-MA。将纯化的DNA注射Balb/c小鼠股四头肌。经免疫的动物产生抗EB病毒MA特异性的抗体和中和抗体,依赖抗体细胞介导的细胞毒作用(ADCC),特异性T淋巴细胞增生性反应及细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤作用。基因免疫与基因-蛋白联合免疫效果相似。不同启动子控制下的MA基因,诱发小鼠免疫应答无明显差异。  相似文献   

10.
从棒状杆菌SCB3058克隆得到两个2,5-DKG^**还原酶基因后,构建了两个能够表达2,5-DKG还原酶的基因工程大肠杆菌BL21(DE3)PET9aⅡ和DH5α(pBL4)和一个基因工程欧文氏菌ER97。2,5-DKG还原酶基因分别受控于PL或T7启动子,通过加入IPTG或提高温度进行诱导,SDS-PAGE和酶活测定确定它们在诱导后得到了高表达,用细胞抽提液在加入辅酶NADPH的体外实验中转  相似文献   

11.
金属硫蛋白有α、β两个结构域(dom ain),其中α结构域优先结合Cd2+ 和Hg2+ .小鼠αα突变体在大肠杆菌中已经构建并得到表达,其转基因植株已得到,可在Cd300(300 μm ol/L)中生长.为了进一步提高外源基因在烟草中的表达量,首先用PCR 的方法设计引物,在基因翻译起始密码子ATG 附近加入植物偏爱的碱基组合AACAATG.另外,将该突变体基因插入具有双35 S(CaMV35S)强启动子的植物双元表达载体pGPTVd35S-BAR中,获得了带有αα突变体的植物双元表达载体.通过农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草NC89,获得了抗除草剂的转基因植株.经PCR-Southern 和蛋白Dot-blotting 检测,证明了αα突变体在烟草中的嵌合与表达.抗重金属实验证明转基因烟草可以在Cd400(400 μm ol/L)中生长.  相似文献   

12.
人Mn—SOD cDNA的克隆及高效表达   总被引:13,自引:0,他引:13  
用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),以人肝细胞株(L02)总RNA为模板,扩增了人锰超氧化物歧化酶(hMn-SOD)的cDNA。重组到T7启动子控制下的表达载体pET-24a(+)中,构建表爱质粒pET-MnSOD,并转化大肠杆菌BL21(DE3)。SDS-PAGE及蛋白质印迹分析表明,经1mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后,可高效表达一分子量为22kD的蛋白质,与抗人  相似文献   

13.
水稻重复序列RRD3在转基因植物中的启动子功能   总被引:10,自引:0,他引:10  
来源于水稻(Oryza sativa L.)的一个820bp多拷贝重复序列RRD3,含有植物启动子TATA-box、CAAT-box等特征保守基元。用RRD3取代Ti载体pB1121中的CamV 35S启动子,通过植物转化鉴定RRD3的启动子功能。组织化学分析表明,根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens(Smith et Townsend) Conn)LBA4404转化后  相似文献   

14.
霍乱弧菌zot基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达   总被引:2,自引:0,他引:2  
从霍乱疫苗菌中抽提基因组DNA,用PCR的方法扩增zot基因。序列分析表明,zot基因编码399个氨基酸,其中4个氨基酸与文献报道有差异。将zot基因插入含T7启动子的质粒pET-28(a+)构建表达质粒pET-ZOT,转化大肠檑菌BL21(DE3)筛有达菌株BLZOT。表达菌株经1mmol/LT IPTG诱导表达3-5h后,表达大量ZOT蛋白,并形成包涵体,经SDS-PAGE分析重组ZOT蛋白分  相似文献   

15.
CD3ε和PMA对fas基因转录调控作用的研究   总被引:2,自引:0,他引:2  
研究了CD3ε和PMA对细胞凋亡基因fas的转录调控作用.根据已知的人fas基因5'上游序列设计引物,用PCR法从人胸腺细胞基因组DNA中扩增出fas5'上游长为446bp的启动子片段.将此片段定向克隆到以虫荧光素酶为报告基因的真核细胞表达载体pXP2中.经限制性内切酶酶切鉴定及序列测定分析表明此重组表达质粒DNA的结构和序列正确.用此质粒(pXP2-fasup)瞬时转染人JurkatT淋巴细胞,分析报告基因的表达水平.结果表明fas基因上游-506到-60的区域有弱启动子活性,约是阴性对照的1.5倍.抗CD3ε抗体和PMA处理均可增强fas启动子的活性,促进报告基因的表达,其虫荧光素酶活性分别是未经处理的pXP2-fasup转染细胞的1.7倍和3.3倍,但二者没有协同作用.PKC的抑制剂staurosporine和PTK的抑制剂herbimycinA可抑制PMA诱导的fas基因转录,使虫荧光素酶基因的表达降至未用PMA处理的水平.但PTK的另一种抑制剂genistein可与PMA发挥协同作用,上调fas基因的转录,使虫荧光素酶活性增加到5倍.这些结果为阐明CD3ε及PMA介导T淋巴细胞激活和凋亡的分子机制  相似文献   

16.
人铜锌超氧化物歧化酶cDNA的克隆,测序及表达   总被引:16,自引:1,他引:16  
用逆转录聚合酶链反应(RTPCR),以人胎肝组织总RNA为模板,扩增了人铜锌超氧化物歧化酶(hCu,ZnSOD)的cDNA,并进行序列分析,将该hCu,ZnSODcDNA重组到T7启动子控制下的分泌型表达载体pET22b(+)中,构建表达质粒pETSOD,并转化大肠杆菌BL21(DE3)。SDSPAGE及蛋白质印迹分析表明,经1mmol/L异丙基硫代βD半乳糖苷(IPTG)诱导后,可高效表达一分子量为19kD的蛋白质,与抗人SOD多抗有特异的免疫反应,表达量约为菌体总蛋白质的30%,具有特异性SOD酶活性,酶活力可达1797u/ml培基。  相似文献   

17.
一个高效表达,快速纯化大肠杆菌精氨酰—tRNA合成酶的 …   总被引:1,自引:0,他引:1  
编码大肠杆菌精氨酸-tRNA合成酶的基因argS被克隆到pMFT7-5载体上。将此质粒转化的大肠 力JM109(DE3)中,该转化子粗抽液的比活是宿主菌的2500倍。通过DEAE-Sepharose CL-6B FastFlow和BlueSepharose CL-6B两步柱层析在一天内即可将精氨酰-tRNA合成酶纯化至电泳一条带,比活为36000u/mg,总收率可达69%。  相似文献   

18.
人GM—CSF cDNA的克隆和在大肠杆菌中的表达   总被引:3,自引:0,他引:3  
从诱导的人胚肺细胞HFL株中提取总RNA.经RT-PCR反应获取了人GM-CSFcDNA,DNA序列测定表明其顺序与文献报道完全一致。为了获得高效表达,应用PCR改造了人GM-CSF的cDNA5’端核苷酸序列,并将改造的人GM-CSF基因插入含T7启动子的质粒pET-11d构建成表达质粒pETC-5,将此质粒转化大肠杆菌株BL21(DE3)得到表达菌株BLEC4。表达菌株用0.5mol/LIPTG诱导2小时后,产生大量重组蛋白并形成包涵体。SDS—PAGE电泳图谱扫描结果表明,rhGM-CSF产量占菌体总蛋白量的16%。ELISA和TF-1细胞培养测定表明,初步纯化和复性的rhGM-CSF具有天然的hGM-CSF生物活性。  相似文献   

19.
将携带有T7噬菌体RNA聚合酶基因的质粒和neo抗性基因质粒共转化CHO细胞,经狭缝RNA和Southern blot杂交实验证实获得表达T7噬菌体RNA聚合酶基因的细胞株。pT7CAT质粒转染未表达和表达的细胞株,实验显示两者都能表达报道基因,但效率不同。实验构建了不同表达水平的T7启动子表达系统。  相似文献   

20.
对巴西固氮螺菌draTG上游区域进行了全序列分析,结果表明该区域除了编码部分nifH基因外(nifH与draTG转录方向相反),不编码任何其它已知的基因。但在该区域发现了一些可能的调控序列,它们包括上游激活序列(UAS)、下游启动子组份(DPE)和富A+T区。这说明:nifH与draT间的区域可能主要起调控功能而非编码功能;dra操纵元(operon)的启动子很可能是RpoN-依赖型。用pAF300做载体,构建了draT∷cam转录融合质粒pAT1,并通过检测Cmr以检测draT在大肠杆菌和巴西固氮螺菌中的表达,结果表明draT在LD丰富培养基上,好氧条件下,只在巴西固氮螺菌中才表达。这说明,draT的转录需要某种大肠杆菌中没有的因子,同时也表明draTG上游区域有启动子功能。利用启动子探针质粒载体pCB182,构建了draT∷lacZ转录融合质粒pCT1。在大肠杆菌中测定肺炎克氏杆菌NifA对draT∷lacZ的转录激活作用。结果表明nifA并不参与draT的转录调控。  相似文献   

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