无色杆菌蛋白酶Ⅰ肽链N端作用的突变研究

无色杆菌蛋白酶Ⅰ（AchromobacterproteaseⅠ,APⅠ）是高度专一于赖氨酸的丝氨酸蛋白酶．比较其它典型同类蛋白酶的一级结构,该酶的成熟体肽键在N端和C端分别长出9个和26个氨基酸践基．在其N端设计和构建了一些突变体,它们分别具有缩短或延长的N端．这些突变体低于天然酶的活性和稳定性的结果揭示,N端这部分延长在稳定该酶的活性构象方面起着重要作用．     

无色杆菌蛋白酶Ⅰ突变体的结构与稳定性研究

报道了用定位诱变技术，改变无色杆蛋白酶Ⅰ的酶原加工位点，使其向左或向右移动，导致突变体成熟酶的肽链从Ｎ端延长或缩短若干氨基酸残基。所获突变体显示了低于野生酶的活性。突变体的园二色谱和荧光光说研究表明，它们的结构发生了某些微小的改变。在不同的ＰＨ值的，温度和不同浓度的ＳＤＳ和盐酸胍条件下，也表现了低于天然酶的稳定性。     

无色杆菌蛋白酶Ⅰ突变体的结构与稳定性研究

报道了用定住诱变技术,改变无色杆菌蛋白酶Ⅰ的酶原加工位点,使其向左或向右移动,导致突变体成熟酶的肽链从N端延长或缩短若干氨基酸残基．所获突变体显示了低于野生酶的活性．突变体的园二色谱和荧光光谱研究表明,它们的结构发生了某些微小的改变．在不同的pH值、温度和不同浓度的SDS和盐酸胍条件下,也表现了低于天然酶的稳定性．在N端延长的突变体中,酶原加工位点越远离天然加工位点的突变体,显示了越低的活性和稳定性．缩短的突变体活性和稳定性最低．这些结果表明,天然成熟酶的N端可能比较靠近酶的活性中心,并参与构成活性中心附近的局部构象由此可见N端区在成熟酶的结构与功能方面的重要作用．     

枯草杆菌蛋白酶突变体的纯化和晶体生长

应用基因工程手段,获得了枯草杆菌蛋白酶Ｅ的双突变体基因（Ｍ２２２Ａ,Ｎ１１８Ｓ）,此基因在枯草芽孢杆菌中表达得到了既抗氧又耐高温的碱性蛋白酶,含Ｍ２２２,Ｎ１１８Ｓ碱性蛋白酶基因的枯草杆菌发酵液经过硫酸铵分级沉淀和ＤＥＡＥＳｅｐｈａｄｅｘＡ－２５阴离子交换层析柱,再在ＦＰＬＣ层析系统上用Ｈｉｌｏａｄ２６／１０ＳＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ阳离子交换柱分离得到ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳纯的蛋白酶样品。突变体酶的等电点为ｐＨ８．９,分子量为２７４００,用四肽底物测得的动力学参数也有较大的变化。对该突变体酶进行了晶体生长研究,获得了较大的单晶体。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2蛋白原核表达纯化及其蛋白酶活性分析

摘要：【目的】表达并纯化猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白2（Nsp2）,分析Nsp2的蛋白酶活性。【方法】本研究通过PCR分别扩增nsp2基因的N端和C端,利用原核表达载体pET21a(+)表达Nsp2蛋白的N端和C端(即Nsp2-N 和 Nsp2-C),通过Ni-NTA琼脂糖亲和层析和凝胶过滤的方法纯化两个重组蛋白。预测Nsp2-N含有半胱氨酸蛋白酶结构域,本研究利用western blot检测其顺式酶切蛋白酶活性;并人工合成潜在的十肽底物,利用体外多肽酶切实验检测其反式酶切蛋白酶活性。成功获得Nsp2     

热稳定和抗氧化的枯草杆菌蛋白酶E双突变体(M222A,N118S)的结晶和初步晶体学研究

对具有热稳定和抗氧化性质的枯草杆菌蛋白酶Ｅ双突变体（Ｍ２２２Ａ,Ｎ１１８Ｓ）进行了初步晶体学研究。应用悬滴式汽相扩散法生长出了该酶突变体的单晶体,蛋白酶抑制剂对防止酶自溶、稳定蛋白质构象和生长出合用的单晶体起到了重要作用。该晶体的空间群为Ｐ２１,晶胞参数为ａ＝５３．０５,ｂ＝７４．８４,ｃ＝６８．７４,β＝９７．２４°,每个不对称单位里含两个分子。已用面探测器衍射仪收集了一套２．５分辨率的Ｘ射线衍射数据。     

虫光素酶N端16个氨基酸与催化活性密切相关

把全长虫光素酶基因及其缺失突变体(5′端缺失48个核苷酸)分别克隆到分泌型表达载体pIN-Ⅲ-ompA3,前者转化体能表达高活性虫光素酶,而后者完全丧失酶活.该结果表明虫光素酶N端16个氨基酸与酶活性密切相关.     

枯草蛋白酶E的定点突变及其对酶性质的影响

用定点突变的方法研究S221C/P225A,N118S/S221C/P225A,D60N/S221C/P225A和Q103R/S221C/P225A突变对蛋白酶活性,酯酶活性与蛋白酶活性之比的影响。结果表明：S221C/P225A突变使蛋白酶活性比枯草蛋白酶E低73000多倍,酯酶活性与蛋白酶活性之比是Subtiligase的3倍;N118S/S221C/P225A突变使蛋白酶活性和酯酶活性分别比S221C/P225A突变下降3.6倍和15倍,酯酶与蛋白酶活性之比下降4倍,同时增加变体酶的热稳定性;D60N/N118S/S221C/P225A突变使蛋白酶活性比N118S/S221C/P225A突变体下降15倍,但对酯酶活性几乎没有影响,酯酶与蛋白酶活性之比增加14倍,分别是S221C/P225A突变体和Subtiligase的3.3倍和10.3倍;但是,Q103R/N118S/S221C/P225A突变使蛋白酶活性比N118S/S221C/P225A突变体增加5倍,酯酶活性下降55倍,酯酶与蛋白酶活性之比下降1000倍。     

地衣芽胞杆菌来源角蛋白酶N端对活力及其热稳定性的影响

【目的】通过对一株地衣芽孢杆菌来源的角蛋白酶N端进行分子改造,研究其对角蛋白酶活力和热稳定性的影响,进而提高角蛋白酶的热稳定性。【方法】将角蛋白酶N端前5个氨基酸进行分段缺失,并通过序列比对将N端的前5个氨基酸替换为来源于Thermoactinomyces vulgaris的嗜热蛋白酶的N端,将野生型和突变体角蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌WB600中进行表达,并对重组酶进行纯化与酶学性质研究。【结果】角蛋白酶N端不同长度的缺失大幅度地降低了角蛋白酶的活力,其中缺失前5个氨基酸完全丧失了酶活力。将角蛋白酶N端前5个氨基酸替换为嗜热蛋白酶N端前12个氨基酸,虽然降低了近70%的活力,但是却增加了角蛋白酶的热稳定性,60°C条件下的半衰期t1/2由原来的9 min提高到20 min。【结论】角蛋白酶的N端对其酶活力具有较大的影响,与嗜热蛋白酶来源的N端进行替换可以有效提高角蛋白酶的热稳定性。     

人血小板生成素（hTPO）的cDNA克隆,序列测定及其在COS—7细胞中的表达

本文利用反转录ＰＣＲ技术从人胎肝ｍＲＮＡ中分别扩增出ｈＴＰＯ　Ｎ－端和Ｃ－端两个ｃＤＮＡ片段,然后经酶切分别连接重组到质粒ｐＵＣ１９中进行序列分析,在确证其序列与国外文献报道完全一致的基础上,酶切、回收、连接其Ｎ－端、Ｃ端ｃＤＮＡ,并以此为模板,用ＰＣＲ法扩增出全长ＴＰＯｃＤＮＡ片段,并将其重组到穿梭质粒ｐＳＶＫ３中,在ＣＯＳ－７中进行了瞬时表达并检测出表达产物的活性     

雄性不育水稻农垦58S的P61蛋白质是叶绿体ATP酶β亚基的同工型

Ｐ６１蛋白质是从水稻（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．ｓｓｐ．ｊａｐｏｎｉｃａ）雄性不育突变体农垦５８Ｓ（ＮＫ５８Ｓ）叶绿体中发现的一个蛋白质,微序列分析结果表明它的Ｎ端氨基酸序列与水稻和大麦叶绿体ＡＴＰ酶β亚基的一致。免疫印迹分析证明Ｐ６１与玉米叶绿体ＡＴＰ酶β亚基抗体有特异性的交叉反应。Ｐ６１与常规水稻“农垦５８”（ＮＫ５８）的β亚基的分子量基本相同,但其等电点偏碱性端,与β相差约０．３个ｐＨ     

哺乳动物DNA甲基化酶

哺乳动物ＤＮＡ甲基化酶分子量较大,对蛋白水解酶非常敏感。该酶优先作用于半甲基化ＤＮＡ中的ＧｐＧ序列的胞嘧啶;基Ｃ－端约５００ａａ帱１０个微区构成,具有较强的保守性;而Ｎ－端约３５０ａａ带电荷和极性较强,但易被蛋白酶水解。而甲基化的完成则可能采用“没动”机制。     

rBTI及其突变体对C. elegans寿命的影响

重组荞麦胰蛋白酶抑制剂（recombinant buckwheat trypsin inhibitor,rBTI）是一种来源于荞麦Potato Ⅰ抑制剂家族的丝氨酸蛋白酶抑制剂,具有很好的生物活性及功能。先前的研究表明,rBTI在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中具有很好的延长寿命的性质,但其具体的作用机制还不太清楚。本文的研究证明,rBTI能够调节转录因子DAF-16的转录活性,进而影响线虫的寿命,且该性质与其胰蛋白酶抑制活性密切相关。通过定点突变技术,分别对rBTI的45位、53位和44位氨基酸活性位点进行突变,获得了4种不同胰蛋白酶抑制活性的rBTI突变体,分别命名为rBTI-R45A,rBTI-R45F,rBTI-W53R和rBTI-P44T。经典模式生物秀丽隐杆线虫寿命检测实验显示,野生型rBTI可以明显延长C.elegans的寿命,且在0～10 μmol/L 范围内具有浓度依赖性。和未处理对照组相比,10 μmol/L 野生型rBTI延长寿命幅度可达到14.5%,但是突变体rBTI-R45A,rBTI-R45F和rBTI W53R均不同程度失去了延长寿命的功能。利用荧光显微观察及qRT-PCR等方法进一步研究发现,野生型rBTI 可增强寿命调控转录因子DAF-16的转录活性。与寿命检测实验结果一致,4种 rBTI突变体均不能使DAF-16转录活性增强。上述结果表明,在C.elegans中,rBTI可增强长寿因子DAF 16的转录活性,进而延长虫体寿命,且该功能的发挥依赖于其适当的胰蛋白酶抑制活性。本文的结果为进一步研究开发rBTI的功能提供了实验支持和理论基础。     

SARS冠状病毒蛋白酶3CLpro N-finger多肽是酶活性所必需

构建了SARS冠状病毒主要蛋白酶3CL^pro及其缺失N端七肽即N-finger的突变体3CL^pro（△1-7）融合表达质粒,并于大肠杆菌表达系统中表达。得到的融合蛋白经肠激酶酶切,亲和层析,最终得到纯化的3CL^pro。及其突变体3CL-（△1-7）。酶活性实验显示,去除N-finger多肽的突变体3CL^pro（△1-7）丧失了3CL^pro所具有的对含有其自动水解位点的荧光底物的水解活性,表明处于非酶活性中心的N—finger多肽是酶活性所必需的。利用固相合成法,进一步合成了N—finger七肽。酶抑制实验表明N—finger七肽表现了对3CL^pro部分竞争抑制活性。     

枯草杆菌蛋白酶突变体的纯化和晶体生长

应用基因工程手段,获得了枯草杆菌蛋白酶Ｅ的双突体基因（Ｍ２２２Ａ,Ｎ１１８Ｓ）,此基因在枯草芽孢杆菌表达得到了既抗氧又耐高温的碱性蛋白酶。含Ｍ２２２,Ｎ１１８Ｓ碱性蛋白酶基因的枯草杆菌发酵液经过硫酸铵分级沉淀和ＤＥＡＥＳｅｐｈａｄｅｘＡ－２５阴离子交换层析柱,再在ＦＰＬＣ层析系统直用Ｈｉｌｏａｄ２６／１０ＳＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰ阳离了交换柱分离得到ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳纯的蛋白酶样品,突变体酶的等电     

黑曲霉Aspergillus niger 963植酸酶基因phyA2 N-糖基化突变体的构建与表达分析

为研究N-糖基化对黑曲霉Aspergillus niger963植酸酶蛋白酶学性质的影响,利用Megaprimer PCR介导基因定点突变的技术,构建了植酸酶phyA2基因两个N-糖基化突变体,即将该基因编码蛋白质N87位和N102位的天冬酰胺密码子置换为编码与其具有相似结构的谷氨酰胺密码子,两个突变体分别命名为N87Q、N102Q,经测序结果比对和图谱分析,表明在核酸水平上成功实现了点突变,构建了酵母表达载体pPIC9-N87Q,pPIC9-N102Q,转化毕赤酵母GS115,经发酵罐水平诱导表达后,获得了N-糖基化缺失突变蛋白,对突变体蛋白在60℃进行处理发现,突变体N87Q处理1h后剩余50%的酶活,N102Q处理10min后酶活完全丧失,在37℃,不同的pH缓冲体系(pH1~10)处理1h,N87Q剩余约大于70%的活性,而N102Q在pH8的环境下,没有检测到酶活。     

木糖异构酶突变体的研究——替代氨基酸对分子表面环柔性的影响

天然球蛋白分子表面暴露的柔性的环是对蛋白质水解作用最敏感的部位,可用蛋白质部分水解来确定木糖异构酶突变体上的这些部位,枯草杆菌蛋白酶对Ｗ１３６Ｅ单体的水解在一级反应图上呈折线,对Ｔ８９Ｓ和Ｖ１３４１单体的部分水解为直线。对镁－酶的水解速度低于对脱辅基酶的水解速度。枯草杆菌蛋白酶对Ｗ１３６Ｅ的第一个水解位点在Ａｌａ２８,Ｔｈｒ２９之间,第二个水解位点在肽链的Ｃ端。     

N端截短CBM41对枯草芽孢杆菌来源普鲁兰酶酶学性质的影响

采用N端截短方式对Bacillus subtilis 168来源普鲁兰酶进行蛋白结构改造,构建不同形式的截短突变体,考察N端结构对酶学特性的影响。利用基因工程的手段分别删去CBM41结构域N端前2、4和6个氨基酸,获得突变体M1(ΔN2)、M2(ΔN4)和M3(ΔN6)。3种突变体最适反应温度(40-45℃)和最适pH(6.0)均与WT一致,WT、M1、M2和M3的T_m值分别为48.57℃、50.03℃、48.43℃和49.50℃,M1、M2和M3的比活力均高于野生型,是WT的1.18、1.60和2.44倍,WT、M1、M2和M3的K_m值分别为23.89、29.01、17.29和19.08 mg/mL。上述结果表明,通过截短普鲁兰酶N端氨基酸可获得性质得到改良的突变体,为提高该酶的热稳定性、比活力和底物结合能力提供新的方法和思路。     

重组旋毛虫plancitoxin-1-like活性位点突变体蛋白的核酸酶活性

旋毛虫plancitoxin-1-like(Ts-Pt)是旋毛虫125种DNaseⅡ家族蛋白中唯一具有典型DNaseⅡ活性区域HKD基序的核酸酶,且普遍认为,组氨酸位点是DNaseⅡ的活性氨基酸位点。为研究Ts-Pt活性位点突变体蛋白的核酸酶活性,利用重叠PCR方法获得Ts-Pt活性位点突变体片段,以p ET-28a(+)为载体构建重组表达质粒并在大肠杆菌中诱导表达。重组Ts-Pt突变体蛋白经亲和层析纯化后进行SDS-PAGE分析。利用琼脂糖凝胶电泳法和核酸酶酶谱分析重组Ts-Pt突变体蛋白的核酸酶活性。成功构建含Ts-Pt突变体重组质粒的基因工程菌,SDS-PAGE和亲和层析纯化结果显示,重组Ts-Pt突变体蛋白呈包涵体表达。重组蛋白经复性后并没有表现出核酸酶活性,但核酸酶酶谱分析结果显示,包涵体表达的重组Ts-Pt突变体蛋白表现出降解DNA的能力。同时,N端和C端活性位点H及HCK和DHSK突变并不影响Ts-Pt的核酸酶活性,研究结果为进一步研究庞大的DNaseⅡ家族蛋白在旋毛虫发育和感染方面的作用提供一定的参考。     

粘质赛氏菌胞外蛋白酶的氨基酸组成、N端序列及其部分性质

终浓度为５ｍｍｏｌ／Ｌ的ＥＤＴＡ可彻底抑制粘质赛氏菌４１００３（２）胞外蛋白酶活力,而Ｃａ２＋可以回复部分酶活力,表明Ｃａ２＋为酶活力所必需;Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、Ｆｅ２＋等金属离子对酶具有不同程度的抑制作用;５－磷酸吡哆醛及对甲氧基苯甲醛对酶具有明显的激活作用;以酪蛋白为底物,采用双倒数法求得酶的Ｋｍ值为６．６７ｍｇｍｌ－１;Ｎ,Ｎ－二甲基酪蛋白也是酶的理想底物;经酸水解,测定出酶的氨基酸组成;利用蛋白质自动分析仪测定了酶的Ｎ端９个氨基酸序列．比较来源不同的粘质赛氏菌胞外蛋白酶的Ｎ端序列,发现它们之间存在一定程度的同源性,并且存在特定的通读结构Ａｌａ…Ａｓｐ…Ｇｌｙ．