基于核酶技术的人线粒体色氨酸tRNA的高效转录及其活性鉴定

利用T7RNA聚合酶(T7 RNA polymerase,T7 RNAP)的体外转录方法因其简便、高效而在RNA制备中得到广泛应用,但该法由于T7RNAP的启动子跨越转录起始位点而会导致转录产物多出附加序列;如果去掉T7启动子的转录起始位点,则会严重降低T7RNAP的转录活性。本实验很好地消除了以上弊端,将T7RNAP的高效转录系统与核酶高度专一的自剪切技术相结合,成功构建了一种不影响转录效率的体外转录方法,而且转录后核酶能够在设计的特定位点进行自剪切并释放出目的RNA,得到了活性达113.6pmol/μg的人线粒体色氨酸tRNA(HmtRNATrp(UCA))。该方法转录效率高、重复性好,适合RNA的大量精确制备。     

锤头状核酶对转化生长因子β1 RNA的体外剪切作用

为研究转化生长因子β1（TGFβ1）在造血调控中的关键作用, 构建针对抗转化生长因子β1的锤头状核酶, 并对它的体外剪切活性进行探讨. TGFβ1 cDNA部分基因片段其克隆入T载体中, ３２Ｐ标记TGFβ1体外转录物, 变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化获得靶RNA.计算机设计抗TGFβ1的锤头状核酶, 并把合成的核酶基因片段克隆入pGEM-9Zf(-)中T7启动子的下游, 凝胶电泳纯化回收３２Ｐ标记核酶的体外转录物.在不同条件下进行核酶的剪切反应, 变性PAGE, 放射自显影.活性的Rz445在37℃时具有良好活性, Km为29.55 nmol/L, Kcat为0.1533 min－1, 突变型核酶Rz445m没有剪切活性.制备的Rz445在体外具有良好的特异催化剪切活性, 并有望胞内抑制TGFβ1表达, 从而在干细胞移植中应用.     

基于DNA和RNA的双功能Semliki森林病毒复制子载体的构建

以semliki森林病毒衍生的复制子载体pSFV1和辅助载体pSFV-helper2为骨架, 用CMV IE和T7启动子替换SP6启动子并在3′ UTR下游插入BGH转录终止子,构建了基于DNA和RNA的复制子表达载体pSMCTA和辅助载体pSHCTA。在DNA和RNA二种递送方式上证实该表达载体可高水平表达外源基因,与辅助载体共转染可制备具有感染能力并能表达外源基因的重组病毒颗粒。构建的基于DNA和RNA的双功能复制子载体显著地提高SFV载体应用范围,在体外可用于高水平表达外源基因及大规模制备重组病毒颗粒,在体内也可用于研制复制子疫苗和基因治疗载体。     

特异切割马铃薯纺锤形块茎类病毒负链的多价核酶的构建和体外活性测定

根据锤头型核酶的作用模式 ,设计、合成并克隆了特异切割马铃薯纺锤形块茎类病毒 (PSTVd)负链RNA不同区域位点的双价和三价锤头型核酶基因。通过体外转录 ,将PSTVd负链RNA分别与双价和三价核酶混合 ,37℃温育 2h。结果表明 ,双价核酶和三价核酶均表现出较高的切割活性 ,其中双价核酶处理的切割产物的大小与理论值相符合。三价核酶虽表现出较高的切割活性 ,但只是其中一价核酶在起作用。讨论了二价和三价核酶的应用前景。     

双位点核酶对乙型肝炎病毒C基因体外转录物的剪切作用

为探讨双位点核酶对乙型肝炎病毒C基因体外转录物的剪切作用,观察双位点核酶对单一核酶体外剪切的增强作用,同时比较串联核酶和混合核酶的体外切割作用,构建了核酶Rz1,Rz3, Rz1和Rz3的串联核酶(Rz13)体外转录载体, 经体外转录后切割靶RNA. 结果表明:双位点核酶,无论是串联或混合核酶均可增强单一核酶的体外切割作用, 串联和混合核酶中的单一核酶可独立发挥作用;当串联和混合数目为2个时,两者的切割效率差别不大(P＞0.05).     

乙脑病毒全长cDNA的扩增克隆及体外转录制备感染性RNA的研究

本研究根据已知的乙脑病毒(JEV)SA14株基因序列设计一套引物 ,利用长模板RT-PCR 技术,一次扩增出了JEV的全长cDNA,并采用大片段克隆技术将其克隆于载体的RNA聚合酶启动子下游.阳性克隆转录的RNA转染HBK细胞后细胞产生病变,经乳鼠脑内接种及特异性免疫荧光染色证明为JEV,这一结果表明JEV感染性克隆的构建获得了成功.其次,合成一条含有 RNA聚合酶启动子序列的5′引物,利用长模板RT-PCR方法扩增出带有启动子的JEV全长cDNA ,以此cDNA为模板作体外转录.转录产物转染BHK细胞后观察到了典型的JEV病变.收获的病毒经乳鼠脑内接种及免疫荧光染色证明为JEV,从而建立了制备JEV感染性RNA的快捷方法.本研究构建的JEV感染性克隆与建立的长模板RT-PCR快速制备JEV感染性RNA的方法,将为JEV 分子生物学研究的后续工作提供有力的工具和奠定坚实的基础.     

GS介导RNase P对人巨细胞病毒ul54基因mRNA的切割作用

引导序列(Guide Sequences,GSs)是与mRNA靶序列互补并引导RNase P切割的小RNA片段。设计与人巨细胞病毒HCMV(Human Cytomegalovirus,HCMV)ul54基因D片段mRNA序列互补的GS,将其共价结合到大肠杆菌来源RNase P催化核心M1 RNA,构建成T7-M1GS核酶。通过对ul54基因D片段转录产物体外切割实验和将T7-M1GS构建在含有U6启动子的逆转录病毒载体,与构建在真核载体pEGFP-N1的ul54基因D片段共转染人宫颈癌细胞系HeLa的体内切割实验,证实该核酶具备对ul54基因D片段mRNA的特异切割能力,为利用核酶治疗HCMV感染提供实验基础。     

GS介导RNaseP对人巨细胞病毒μ154基因mRNA的切割作用

引导序列（Guide Sequences,GSs）是与mRNA靶序列互补并引导RNase P切割的小RNA片段。设计与人巨细胞病毒HCMV（Human Cytomegalovirus,HCMv）μ/54基因D片段mRNA序列互补的GS,将其共价结合到大肠杆菌来源RNase P催化核心M1 RNA,构建成T7-M1GS核酶。通过对μ/54基因D片段转录产物体外切割实验和将T7-M1GS构建在含有U6启动子的逆转录病毒载体,与构建在真核载体pEGFP-N1的μ/54基因D片段共转染人宫颈癌细胞系HeLa的体内切割实验,证实该核酶具备对μ/54基因D片段mRNA的特异切割能力,为利用核酶治疗HCMV感染提供实验基础。     

专一切割苹果锈果类病毒多体自切割核酶的克隆和转录物的体外活性测定

将苹果锈果类病毒的1个14nt的靶序列连接在锤头型核酶的3′末端,构成自切割核酶。经人工合成和PCR扩增,克隆在转录载体pGEM7zf（＋）的XhoⅠ-Hind Ⅲ位点。利用限制酶Xho I与SalI的连接,消失其识别位点序列,将自切割核酶片段插入到重组质粒中,经连续5次亚克隆,分别获得2、4、6、8、10和12拷贝的多体自切割核酶。在T7RNA聚合酶作用下,线性化重组质粒转录的多体自切割核酶通过内部的顺式切割释放出较多数量的核酶分子,提示在转录水平能够提高核酶转录物的浓度。用相同摩尔浓度的单体和12体自切割核酶分别对32P标记的靶ASSVd进行反式切割,核酶与靶RNA摩尔浓度比为1：1。放射自显影结果表明：多体自切割核酶对靶ASSVd的切割效率明显高于单体自切割核酶。我们推测多体自切割核酶在体内系统中可能具有更好的应用价值。     

Selection with two alleles and complete dominance

For a plant selection model with frequency-independent viabilities, fertilities and selfing rates, it is shown that apart from global fixation, for certain parameter combinations a protected polymorphism and facultative fixation (either allele may become fixed according to initial frequencies) may both occur. Facultative fixation requires different selling rates for the dominant and recessive type. Protection of the polymorphism requires resource allocation for male and female function. In this connection the problem of purely genetically caused population extinction is discussed.
For general frequency dependence and regular segregation, the chances for establishment of a completely recessive gene are compared to those of a completely dominant gene. It is proven that the process of establishment of the recessive gene, despite a fitness advantage, may be considerably endangered by drift effects if random mating prevails. The recessive gene may reach the same effectivity in establishment as a dominant gene, only if the recessive homozygote mates exclusively with its own type during the period of establishment.     

杆状病毒出芽病毒粒子膜融合蛋白的研究进展

杆状病毒是一类感染节肢动物的病原微生物,其基因组为双链环状DNA,大小为80～180kb.     

Inception of the Modern Public Health System in China and Perspectives for Effective Control of Emerging Infectious Diseases: In Commemoration of the 140th Anniversary of the Birth of the Plague Fighter Dr. Wu Lien-Teh

In this article, we systematically review Dr. Wu Lien-Teh's academic achievements and outstanding contributions in the prevention and control of the plague epidemic in northeast China and introduce the development of the earliest public health epidemic prevention system in China in order to commemorate the 140th anniversary of Dr. Wu Lien-Teh's birth. We hope that this article will provide insights into the effective prevention and control of emerging infectious diseases as well as the current worldwide pandemic of COVID-19, facilitating the improvement and development of public health systems in China and around the globe.