PCR法检测外环境水中脊髓灰质炎病毒Ⅰ型基因的研究

应用聚合酶链反应（PCR）技术检测外环境水中分离的脊髓灰质炎病毒Ⅰ型（PVⅠ）毒株基因型,发现所分离的22株病毒．均为疫苗SabinⅠ相关株．脊髓灰质炎病毒的温度敏感（T特征）试验亦提示为弱毒株,与PCR试验相吻合。表明在实施强化免疫和常规免疫后,外环境中的脊髓灰质炎病毒已被疫苗相关株循环所取代。同时证实用PCR作为环境中PVⅠ病毒株的基因型分析的检测方法是特异和敏感的。     

脊髓灰质炎病毒缺陷型载体瞬时表达系统I的构建

为探索可表达较大片段外源基因的脊灰病毒重组载体,以ＨＢＶ－Ｓ基因置换脊灰病毒的Ｐ１基因,同时以另一途径提供脊灰病毒Ｐ１结构蛋白,经转染入Ｈｅｌａ细胞中形成缺陷型重组病毒颗粒,此病毒可以感染新的细胞,并表达其重组的外源基因,但不产生子代病毒。实验结果表明,这种瞬时表达系统的构建,为脊灰病毒缺陷型重组载体用于基因转导技术打下基础。     

PCR方法检测我国脊髓灰质炎病毒Ⅰ型野毒株的研究

用聚合酶链反应试验（ＰＣＲ）检测我国脊髓灰质炎病毒Ⅰ型（ＰＶＩ）野毒株,仅需５μｌＰＶＩ细胞培养液,方法简便、快速、敏感、特异,用本法对我国１４个省市７９份ＰＶＩ分离株的检测结果,能与检定ｓａｂｉｎⅠ相关株的ＳＩ／ＰＣＲ法的检测结果相印证,与其中３１份核苷酸测序判断为野毒株的结果相一致。其检测阳性率为８４．４％,基本能检测我国流行过的５个ＰＶＩ基因型野毒株。另外,从检测结果看,除北京市未发现野毒株外,其它１３个省区都有野毒株流行,表明当前我国消灭脊灰的任务还很重。     

我国脊髓灰质炎I型野病毒JX基因型特异RNA探针及其应用

及时发现脊髓灰质炎（脊灰）野病毒,是消灭脊灰工作中病毒学监测的首要任务。近期我国存在４个脊灰Ｉ型野病毒基因型,其中Ｐ１／ＣＨＮ－ＪＸ８９和Ｐ１／ＣＨＮ－Ｒ９１为两个主要的流行基因型。在分析了我国大量脊灰野病毒ＶＰ１核酸序列的基础上,选取了１３３８ＪＸ８９病毒ＶＰ１ ５＇端的９６个核苷酸片段（２４８０￣２５７５）,经ＰＣＲ扩增,克隆至ｐＵＣ／１７质粒,线性化后,用Ｔ７ ＲＮＡ多聚酶制备ＲＮＡ探针,并     

重新评价G-480位点变异对I型脊髓灰质炎疫苗病毒神经毒力的影响

在对分离于中国贵州省的9株I型循环的疫苗衍生脊髓灰质炎病毒(cVDPVs)进行全基因组核苷酸序列分析后,发现已知最重要的决定病毒神经毒力的位点G-480和U-525并没有发生回复野生型突变;另外一些已知的神经毒力决定位点,如A-2438、A-2795、C-6203和G-7441等均已经发生了回复野生型突变。根据核苷酸序列的不同,从9株I型cVDPVs毒株中选取5株病毒感染转人脊髓灰质炎病毒受体基因的小鼠进行神经毒力实验,发现它们的神经毒力都有所升高,其中CHN8184株和CHN8229-1.1株的神经毒力已经十分接近P1/Mahoney株,CHN8229-1.1株、CHN8229-2株和CHN8229-3株神经毒力依次递减,但仍处于较高水平,在它们的全基因组中分别只有7个和2个核苷酸的差异,而毒力却相差很多,提示有新的未鉴别的神经毒力决定位点的存在。对这些毒株5′非编码区(5′NCR)的第V结构域进行二级结构预测,发现它们的二级结构很稳定。在G-480位点没有发生回复突变的情况下,部分毒株的神经毒力已经非常接近P1/Mahoney的水平,提示先前的研究中关于G-480突变对I型脊髓灰质炎病毒神经毒力的作用可能被估计过高,G-480位点不是唯一重要的神经毒力决定位点,可能多个核苷酸联合突变才能达到减毒的效果。要真正全面了解P1/Sabin株的减毒机制,还需要进行更加深入的研究。     

利用脊髓灰质炎病毒5‘NCR和RNA聚合酶基因可提高外源基因表达

将含脊髓灰质炎病毒（ＰＶ）ＲＮＡ聚合酶的不同长度基因片段克隆到载体ｐＳＧ５质粒上,分别构建了４个表达ＲＮＡ聚合酶的质粒。体外转录实验证明,ｐＳＧ５－ＰＯＬ１．９９和ｐＳＧ５－ＰＯＬ２．０３质粒转染细胞的提取物促进了特异的ＲＮＡ转录,表明两质闰可表达ＲＮＡ聚合酶。将ＰＶ的５’ＮＣＲ序列插在载体ｐＧＲＥＥＮ ＬＡＮＴＥＲＮ－１的ＣＭＶ启动子下游,构建了ｐＧＲＥＥＮ ＬＡＮＴＥＲＮ－１－５’ＮＣＲ质粒;     

利用脊髓灰质炎病毒5＇NCR和RNA聚合酶基因可提高外源基因表达

将含脊髓灰质炎病毒(PV)RNA聚合酶的不同长度基因片段克隆到载体pSG5质粒上,分别构建了4个表达RNA聚合酶的质粒.体外转录实验证明,pSG5-POL1.99和pSG5-POL2.03质粒转染细胞的提取物促进了特异的RNA转录,表明两质粒可表达RNA聚合酶.将PV的5＇NCR序列插在载体pGREEN LANTERN-1的CMV启动子下游,构建了pGREEN LANTERN-1-5＇NCR质粒;用LacZ基因替换GFP基因分别插入到PGREEN LANTERN-1和pGREEN LANTERN-1-5＇NCR质粒上,构建成 pLacZ LANTERN-1和pLacZ LANTERN-1-5＇NCR质粒.表达RNA聚合酶的质粒与pLacZ 5＇NCR调控表达报告基因的质粒共转染,明显提高了报告基因的表达水平,表明PV的表达调控元件和RNA聚合酶基因可用于构建外源基因高效表达载体.     

一步多重PCR同时检测甲型肝炎和脊髓灰质炎病毒研究

建立的一步ＰＣＲ方法即反转录和ＰＣＲ在同一管中进行,同时检测甲型肝炎和脊髓灰质炎病毒病毒ＲＮＡ。实验中对不同的反转录温度以及一步多重ＰＣＲ的特异性和灵敏度进行了探讨。结果表明：４２℃、５０℃反转录时ｐｏｌｉｏ有非特异性条带出现,６０℃反转录特异性较好,而ＨＡＶ在三种不同的反转录温度下均得到牧场划性较好的条带;应用一步ＰＣＲ同时检测两种病毒与检测单一病毒的灵敏度基本一致,但在同等反应条件下后者的反应效率高于前者,特别是在检测ＨＡＶ时。     

应用套式PCR检测猪细小病毒

从猪细小病毒基因组的ＶＰ２基因上,选择两对引物进行套式聚合酶链反应体外扩增,产物经２％ａｇａｒｏｓｅ凝胶电泳和生物素标记的探针鉴定。证实具有特异性,敏感性实验证明,大套式ＰＣＲ能检测到１ ＴＣｉＤ５０的病毒量,在临床上应用方法能从不同的组织样品和粪便中检测出猪细小病毒,具有很高的敏感性。     

PCR方法检测淋巴结组织中结核菌L型的研究

用聚合酶链反应技术（ＰＣＲ），改良抗酸染色（ＩＫＳ）和结核菌抗体免疫组化染色（ＩＨＣ）三种方法检测６０例淋巴结组织中结核菌Ｌ型感染情况，以病理检查结果分为结核组（１３例），淋巴结非特异性炎症组（３０例）和淋巴结对照组（１７例）。各组三种方法检测阳性率分别为：ＰＣＲ８４．６％（１１／１３），６０％（１８／３０）．２３．５％（４／１７）．ｌＫＳ７６．３％（１０／１３），６６．７％（２０／３０）；１７．６％（３／１７）；ＩＨＣ８４．６％（１１／１３），６３．３％（１９／３０），１１．８％（２／１７）。三者均为阳性者为８０％。结果表明淋巴结非特异性炎症组感染率与结核组相似，与对照组间有显著性差异（Ｐ＜０．０５）。提示：结核菌Ｌ型可能是引起淋巴结非特异性炎症的致病因子之一，ＰＣＲ技术在淋巴结非特异性炎症的病原学诊断上具有重要价值。     

Nested PCR在检测牛白血病病毒前病毒中的应用

用ＮｅｓｔｅｄＰＣＲ检测牛白血病病毒的前病毒形式。从牛白血病病毒基因ｇｐ５１上选择两对引物进行ＮｅｓｔｅｄＰＣＲ体外扩增,产物经２％ａｇａｒｏｓｅ凝胶电泳和用生物素标记的探针鉴定,证实其特异性。结果表明该方法能从两个ＢＡＴ－ＢＬＶ细胞内检测出ＢＬＶ的前病毒ＤＮＡ形式。     

人类T细胞白血病病毒I型pX基因反式调节和致白血病机理的研究进展

人类Ｔ细胞白血病病毒Ｉ型（ＨＴＬＶ－Ｉ）是成人Ｔ细胞白血病（ＡＴＬ）的病因。ＨＴＬＶ－Ｉ基因组中的ｐＸ基因区域编码ｐ４０＾ｔａｘ和ｐ２７＾ｒｅｘ蛋白,前者可反式激活病毒的ＬＴＲ和ＩＬ－２Ｒ及ｃ－ｆｏｓ、ＴＧＦβ１等细胞基因,加强转录过程,在白血病发生中发挥重要作用。ｐ２７＾ｒｅｘ蛋白则在转录后水平进行反馈性调节。白血病的发生机理是多因子参加的多步骤过程。