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相似文献
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1.
用一株基因工程菌E.coli2426/pMN表达了麦芽糖结合蛋白-人神经生长因子融合蛋白.菌体超声破碎后,上清液经直链淀粉亲和柱一步即可获SDS-PAGE纯融合蛋白(55kD),为麦芽糖结合蛋白(42kD)与人神经生长因子(13kD)的络合物,产率约10%.产物用鸡胚背根神经节检测生物活性,1BU不大于10ng,与小鼠颌下腺β神经生长因子具有类似生物活性  相似文献   

2.
以融合蛋白的形式,在Ecoli中经温度诱导表达了小C肽人胰岛素原来似物(B-R2-A),表达的融合蛋白可占细胞总蛋白68%。经磺酸解,及初步分离S-磺酸型融合蛋白,再经CNBr裂解后,进行还原重组,HPLC分离纯化等步骤,每升发酵液可得到B-R2-A约50mg。经酶促转化及DEAE-Sephadex-A25纯化,得重组人胰岛素约20mg,基氨基酸组成与人胰岛素相同,并具有与猪胰岛素相同的生物活性。  相似文献   

3.
以融合蛋白的形式,在E.coli中经温度诱导表达了小C肽人胰岛素原类似物(B-R2-A).表达的融合蛋白可占细胞总蛋白68%.经磺酸解,及初步分离S-磺酸型融合蛋白,再经CNBr裂解后,进行还原重组,HPLC分离纯化等步骤,每升发酵液可得到B-R2-A约50mg。经酶促转化及DEAE-SephadexA-25纯化,得重组人胰岛素约20mg,其氨基酸组成与人胰岛素相同,并具有与猪胰岛素相同的生物活性.  相似文献   

4.
我们构建了新的硫氧还蛋白(Thioredoxin)融合表达载体pETTrxL和pETTrx-HisL,它们可使功能蛋白在大肠杆菌胞质中以可溶性形式高效表达。利用此表达系统成功地获得的hG-CSF-硫氧还蛋白融合蛋白的高效可溶性表达,表达水平达总细胞可溶蛋白的41%以上。所表达的hG-CSF-硫氧还蛋白融合蛋白可通过Cu2+-IDASepharoseFF固相金属螯合层析柱,方便地从细胞破碎可溶上清中直接纯化。所获得的融合蛋白具有hG-CSF特异的生物活性,其比活性达到0.5-1.33×107u/mg融合蛋白。这样表达的hG-CSF融合蛋白能被IgA蛋白酶特异地切割,将hG-CSF从融合蛋白上切下获得与天然蛋白一级结构完全一致的重组hG-CSF 。  相似文献   

5.
目的:通过原核融合表达,获得具有生物活性的重组人神经生长因子(hNGF)的B亚基。方法:分别以大肠杆菌二硫键形成蛋白家族(Dsb)中的DsbA、DsbC蛋白及硫氧还蛋白(Trx)为融合分子,与hNGFB亚基在原核表达系统进行融合表达,优化融合蛋白的复性条件,获得可溶性rhNGFp亚基融合蛋白;通过鸡胚背根神经节培养实验鉴定各融合蛋白的生物活性。结果:在获得的3种融合蛋白中,只有DsbA-L-NGF表现较高的、类似小鼠NGF的生物活性,可观察到其促进鸡胚被根神经节突起生长。结论:人神经生长因子B亚基与DsbA融合蛋白具有良好的生物活性。  相似文献   

6.
苦瓜籽核糖体失活蛋白的理化性质及生物活性   总被引:13,自引:0,他引:13  
采用硫酸铵分级分离,假配基亲和层析和SephacrylS-100分子筛层析等方法,从苦瓜籽中获得核糖体失活蛋白(RIP).经SDS-PAGE、PAGE、IEF和PAS方法分析均表明为单一蛋白着色带或单一糖蛋白着色带.根据SDS-PAGE和Sephadex G-150分子筛层析结果计算其相对分子质量为3.0×104,经IEF-PAGE结果计算其pI为8.9~9.0.对无细胞系统中蛋白质生物合成抑制活性明显,其IC50为5.3×10- 10 m ol/L左右.体外生物活性试验结果表明其对人肝癌细胞、Vero、SP2/0、3T3、Kb、Navana 等肿瘤细胞株均表现有不同程度的抑制作用.而对完整细胞人胚肺二倍体细胞却毒性极小.因此,上述实验结果为该RIP的进一步深入研究和有可能开发成免疫毒素的高效弹头药物提供了一定的工作基础.  相似文献   

7.
采用一种新闻子交换介质Express-IonC(简称IonC)使鼠神经生长因子(mNGF)能得到规模纯化。以鼠颌下腺为原料,匀浆后,经Express-IonC纯化得单一组分的mNGF,用SDS-PAGE测定其相对分子质量约为13.7×10^3,比活约2.3×10^5U/mg。结果表明IonC可替代CM-52,且更适于工因子的规模化生产。  相似文献   

8.
本文用聚合酶链反应(PCR)获得了一个缩短的人巨噬细胞集落刺激因子cDNA基因,并克隆在质粒pAET3d中,在T7启动子指导下,在大肠杆菌BL2LysE中获得了和一个6组氨酸短肽标签的融合表达。重组的融合M-CSF表达量占菌体总蛋白的12%,表达产物一部分以不溶性包涵体形式存在,另一部分则以可溶性蛋白存在。经过金属螯合新和层析一步纯化,所得的融合(His)6-M-CSF在还原型SDS-PAGE上基  相似文献   

9.
人GM—CSF cDNA的克隆和在大肠杆菌中的表达   总被引:3,自引:0,他引:3  
从诱导的人胚肺细胞HFL株中提取总RNA.经RT-PCR反应获取了人GM-CSFcDNA,DNA序列测定表明其顺序与文献报道完全一致。为了获得高效表达,应用PCR改造了人GM-CSF的cDNA5’端核苷酸序列,并将改造的人GM-CSF基因插入含T7启动子的质粒pET-11d构建成表达质粒pETC-5,将此质粒转化大肠杆菌株BL21(DE3)得到表达菌株BLEC4。表达菌株用0.5mol/LIPTG诱导2小时后,产生大量重组蛋白并形成包涵体。SDS—PAGE电泳图谱扫描结果表明,rhGM-CSF产量占菌体总蛋白量的16%。ELISA和TF-1细胞培养测定表明,初步纯化和复性的rhGM-CSF具有天然的hGM-CSF生物活性。  相似文献   

10.
本文用聚合酶链反应(PCR)获得了一个缩短的人巨噬细胞集落刺激因子(编码3~149氨基酸)cDNA基因,并克隆在质粒pET3d中,在T7启动子指导下,在大肠杆菌BL21(DE3)LysE中获得了和一个6组氨酸短肽标签的融合表达。重组的融合m-CSF表达量占菌体总蛋白的12%,表达产物一部分以不溶性包涵体形式存在,另一部分则以可溶性蛋白存在。经过金属螫合亲和层析一步纯化,所得的融合(His)6-M-CSF在还原型SDS-PAGE上基本呈一条均一的蛋白质条带。  相似文献   

11.
本文通过聚合酶链式反应(PCR),从整合有人T细胞白血病病毒Ⅰ型(HTLV-I)的MT-2细胞株中,扩增出HTLV-I外膜蛋白(env)的全基因(1.45kb),并成功地克隆入pUC19载体,构建成env基因克隆env/pUC19.利用原核高效表达载体pGEX-2T,在大肠杆菌中有效地表达了与谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合的env羧基末端抗原的重组蛋白,融合基因的转录由tac启动子调控。SDS-PAGE结果表明,有一约52kD的目的蛋白带,表达量占菌体总蛋白的10%;WesterNblott及ELISA结果显示,表达产物能与HTLV-I多抗血清结合。本研究为研制HTLV-I的诊断试剂及进一步了解env的免疫学和生物学性质打下了基础。  相似文献   

12.
SDS—PAPGE法测定His—tag融合蛋白分子量产生偏差的原因   总被引:5,自引:0,他引:5  
His-tag/Ni-NTA系统是新发展起来的一个亲和纯化重组蛋白有用工具,现常用于基因编码产物的特性研究中。SDS-PAGE是实验室测定蛋白质分子量通常采用的方法,而许多实验室用此方法检测His-tag融合蛋白时却常发现测得的分子量偏大,产生偏差的原因尚未阐明。为弄清这一问题,本实验室在研究一个His-tag融合蛋白P73-His时,首先用SDS-PAGE法测得其分子量确实比理论计算值大,然后对  相似文献   

13.
用PCR法扩增出编码人FAS分子胞外区的cDNA片段,直接克隆到pGEM-T载体上,经DNA序列测定后,再插入到谷胱甘肽转硫酶(GST)融合蛋白表达载体pGEX-KG的EcoRⅠ和SalⅠ位点之间,构成重组质粒pKG-hFAS,将此质粒导入大肠杆菌,经IPTG诱导后获得GST-hFAS重组融合蛋白的表达,用谷胱甘肽偶联的Sepharose4B经亲合层析获得纯化的GST-hFAS蛋白,经凝血酶酶切和二次亲合层析去除GST部分,得到纯化的FAS蛋白.用纯化的FAS抗原免疫家兔制备了抗FAS抗体,经检测发现抗FAS抗体能诱导U937细胞发生细胞凋亡  相似文献   

14.
重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和人单核细胞趋化激活因子(MCAF)融合蛋白经SephadexG-75和CM-SepharoseFF两步柱层析,获得了电泳纯的GM-CSF/MCAF融合蛋白。为进一步研究其结构与功能,我们以纯化的该融合蛋白为抗原免疫家兔制备抗血清。DotELISA和Westernblot试验表明,该抗血清效价高、特异性好,可分别与GM-CSF/MCAF、GM-CSF和MCAF发生反应。  相似文献   

15.
将大鼠乳清酸蛋白(WAP)基因的上游调控序列与人红细胞生成素基因组DNA融合,构建了pWAP-EPO-WAP3乳腺特异性表达载体,该载体经脂质体包裹后,通过显微外科技术,经乳腺导管注入妊娠中后期大鼠乳腺中进行表达。经ELISA检测,大鼠乳汁中有EPO表达,外周血网织红细胞计数法测定表达的EPO具有体内生物活性,说明乳腺导管注入法是一种较理想的评价乳腺特异性表达载体可行性方法  相似文献   

16.
重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和人单核细胞趋化激活因子(MCAF)融合蛋白经SephadexG-75和CM-SepharoseFF两步柱层析,获得了电泳纯的GM-CSF/MCAF融合蛋白。为进一步研究其结构与功能,我们以纯化的该融合蛋白为抗原免疫家兔制备抗血清。DotELISA和Westernblot试验表明,该抗血清效价高、特异性好,可分别与GM-CSF/MCAF、GM-CSF和MCAF发生反应。  相似文献   

17.
庄晨杰  吴昊 《病毒学报》1995,11(2):180-185
建立了测定人α1型基因工程干扰素(rIFN-α)成品中干扰素蛋白含量的酶联免疫分析法(ELISA),并用来测定了随机抽样的10μg/支、20μg/支、30μg/支3种规格rIFN-α1成品中的干扰素蛋白含量。证明测定值与推算值一致,偏差小于10%,而且蛋白含量与生物活性之间呈良好的相关性。本法敏感、特异、快速、简便、灵敏度可达到1ng/ml,检测人γ型基因工程干扰素的蛋白含量呈阴性,还能排除保护剂  相似文献   

18.
一个新的蛋白质剪切系统及其剪切条件的研究   总被引:2,自引:0,他引:2  
将含麦芽糖结合蛋白-内蛋白子-几丁质结合区(简称MYB)基因的重组质粒pMYB129转入E.coli2426,在LB培养基中发酵,IPTG低温诱导表达,菌体超声破碎,离心,上清液经直链淀粉糖亲和层析,获得SDS-PAGE电泳纯的前体蛋白MYB.MYB中内蛋白子的N端可被还原剂CySH、DTT、β-巯基乙醇等诱导发生剪切反应.结果表明,三种还原剂中以DTT为最佳.同时对剪切过程中温度、pH值等影响进行了研究  相似文献   

19.
兔阑尾中一种新的21kD的钙结合蛋白的纯化与鉴定   总被引:3,自引:0,他引:3  
纯化与鉴定了B淋巴细胞中一种新的分子量为21kD的钙结合蛋白(CaBP21)。兔阑尾淋巴细胞匀浆经热变性,Phenyl-Sepharose与DEAE-Sepharose柱层析,自每1kg细胞沉积物中获得SDS-PAGE均一的CaBP215.3mg。HCl水解后的酸性氨基酸(Asp+Glu)含量为26%。如同大多数钙结合蛋白一样,N末端封闭阻止其进行Edman降解。CaBP21中疏水性氨基酸(计Gly,不计Trp)约占46%,碱性氨基酸10%,酸性氨基酸与极性氨基酸约44%。CaBP21有较高的Ser、Tyr含量。肽谱分析等确证CaBP21为2个相同或相似亚基二聚体。以ArsenazoⅢ作Ca2+结合分析表明每分子CaBP21可结合4分子Ca2+,对Ca2+的结合常数约为10-5mol/L。各种性质表明CaBP21是一种不同于其他已知钙结合蛋白的新钙结合蛋白。  相似文献   

20.
人肿瘤坏死因子受体I死亡域融合蛋白基因的克隆与表达   总被引:2,自引:0,他引:2  
通过设计4个引物进行重叠PCR,由此克服了人肿瘤坏死因子受体I死亡域与氯霉素乙酰转移酶(CAT)的融合蛋白基因(DdLcat)。该融合蛋白基因经测序,证明与设计的序列相同。构建成的重组表达质粒pLT10DdLcat转化大肠杆菌后发酵,IPTG诱导2h,SDS-PAGE测定DdLcat蛋白质的分子量为39kD。Western印迹实验进一步作了鉴定。表达产物大部分为包涵体。DdLcat经Q-Sepha  相似文献   

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