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1.
用逆转录病毒载体将单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSVtk)导入恶性肿瘤细胞,随后可应用药物9-(1,3-二羟基-丙氧基-甲基)鸟嘌呤(ganciclovir,GCV)选择性地杀死肿瘤细胞.将HyTK基因替换逆转录病毒载体GlNa中的neo基因,构建成重组逆转录病毒载体GTK,转染混合包装细胞(双噬性PA317细胞和单噬性GP+E-86细胞),通过“乒乓效应”获得高滴度重组病毒.用该重组病毒转染小鼠恶性黑色素瘤细胞系B16细胞,用hygromycinB筛选出阳性细胞克隆(HyTK+),经PCR方法检测证明HyTK基因已成功地导入肿瘤细胞中,且不含可复制的辅助病毒.分别用不同浓度的GCV作用于HyTK-及HyTK+的B16细胞,光镜下观察24h和48h后细胞形态及进行活细胞计数.结果表明,GCV浓度大于0.1μmol/L时即对B16/HyTK+细胞有显著的杀伤作用 相似文献
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HyTK基因转移联合ganciclovir对瘢痕成纤维细胞的体外杀伤作用 总被引:1,自引:0,他引:1
增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的过度增生主要是由于高度增生活性的成纤维细胞的数量异常增多及细胞外基质合成增加所致.用逆转录病毒载体介导单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSVtk)的转移,随后应用药物9-(1,3-二羟基-丙氧基-甲基)鸟嘌呤(ganciclovir,GCV)可选择性地杀死增生细胞.采用组织块贴壁法在体外原代培养成功增生性瘢痕病人的成纤维细胞(FB).重组逆转录病毒GTK转染FB细胞后,用hygromycinB筛选出阳性细胞克隆(FB/GTK),经PCR方法检测证明HyTK基因已成功地导入FB中,但不含可复制的辅助病毒.分别用不同浓度的GCV作用于FB/GTK及FB,光镜下观察不同时间后细胞形态变化及MTT法检测细胞活性.结果表明,GCV浓度大于0.1μmol/L时即对FB/GTK有显著的杀伤作用,且具有强有力的“旁观者效应” 相似文献
3.
利用HSV—TK基因治疗肝癌的离体研究 总被引:2,自引:1,他引:1
利用DNA重组技术,将HSV-TK基因克隆至逆转录病毒载体(XM-6/TK)。经PA317细胞包装后,转染人肝癌细胞HepG2。结果显示,XM-6/TK转染HepG2细胞与野生型相比,其生长特点和细胞形态未有改变。给予抗病毒药物-环氧鸟苷(Ganciclovir,GCV)后,转染细胞生长受到严重抑制,细胞数量明显降低。细胞学检查证实,GCV处理后,转染细胞的死亡率显著增加。本结果提示,应用HSV-TK基因治疗肝癌可能为一种治疗肿瘤新的方法 相似文献
4.
以逆转录病毒pLXSL为载体与人细胞介素2基因(IL-2)重组,用电穿孔技术将其重组子pLIL—2SN导入PA317细胞中,建立了逆转染病毒包装体系细胞PA317/pLIL—2SN。应用逆转录病毒包装体系细胞上清液去转染入肺腺癌细胞SPC—A1,经过20天含G418培液的筛选式培养,历经了50代的传代培养,获得了转白细胞介素2基因的人肺腺癌细胞株SPC-A1/IL-2。该细胞(SPC-A1/IL-2)经PCR技术验证外源性目的基因(IL-2gene)导入细胞内,且证明该细胞能表达IL—2基因(有IL-2的分泌)。我们研究的目的是对肿瘤细胞的特异性抗原修饰、对肿瘤细胞进行处理。试图建立肿瘤疫苗。 相似文献
5.
用逆转录病毒载体表达人粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子 总被引:1,自引:1,他引:1
应用基因工程的方法,将含有巨细胞病毒(CMV)启动子的基因片段和人粒细胞-茂噬细胞集落刺激因子(hGM-GSF)的cDNA,克隆进逆转录病毒载体N2A,得到重组质粒N2QA/CMV/hGM-CSF。经脂质体包装并转染包装细胞,通过G418药物筛选,得到抗生克隆。经PCR和Southern blot检测证实,GM-CSF基因已整合到该克隆细胞的染色体上,获得的逆转录病毒滴度达10^4CFU/ml,克 相似文献
6.
转TK基因的人结肠癌细胞对多种原药敏感性的研究 总被引:2,自引:0,他引:2
构建了含有单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK)的重组逆转录病毒载体LTKSN,经PA317细胞包装后,感染人结肠癌细胞株LoVo.用G418筛选到稳定表达HSV-TK基因的细胞克隆LoVo/LTKSN,LoVo/LTKSN与野生型LoVo细胞相比,生长曲线无明显差异,细胞形态亦无改变,细胞毒试验证明LoVo/LTKSN对GCV的敏感性很高,半杀伤浓度IC50为0.5μmol/L,比野生型细胞提 相似文献
7.
在真核细胞中表达近似于人类天然糖基化的白细胞介素4(hIL-4),为重要的研究课题。利用基因工程技术,以痘苗病毒作为载体,使之在真核细胞中表达hIL-4,为生产糖基化的hIL-4开辟新的可能途径。在痘苗病毒表达载体pJ120质粒的基础上,组建了含有hIL-4基因的pJl20/hIL-4重组质粒,该质粒以痘苗病毒的胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因为侧翼序列,中间插入痘苗病毒的P11和P25两个转录方向相反的启动子,P25的下游连接β-半乳糖苷酶(LacZ)基因,hIL-4基因在痘苗病毒启动子P11控制下进行表达,将PJ120/hIL-4质粒DNA用脂质体转染法导入TK阴性的骨髓瘤细胞(TK143细胞),与预先感染的痘苗病毒在细胞内进行同源序列重组,并且用病毒的核酸杂交鉴定证实,hIL-4基因已重组到痘苗病毒基因组中,用hIL-4应答细胞株检测病毒感染细胞上清,发现重组病毒感染的细胞上清中含有高滴度的hIL-4活性,并对此种情况下hIL-4产生的条件进行了动态观察。 相似文献
8.
胸苷激酶基因治疗胃癌的体外实验 总被引:3,自引:0,他引:3
将单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-tk)导入恶性肿瘤细胞,随后可应用药物丙氧鸟苷(ganciclovir, GCV)选择性杀死肿瘤细胞.构建了含胸苷激酶与潮霉素磷酸转移酶(hph)融和基因(HytK)的真核表达载体LXpsp-HytK.以脂质体(lipofectin)为介导,将这种质粒与仅含潮霉素B基因的质粒LXSH 分别转染胃癌细胞系BGC-823,用60 U/m l潮霉素B进行筛选,得到了可稳定传代的阳性克隆,分别命名为BGC-HytK 和BGC-Hy.三种细胞的生长曲线无明显差别.用不同浓度的GCV 分别作用于BGC-HytK, BGC-Hy 及BGC-823,0.02~200 μg/m l 的GCV 对BGC-HytK 细胞有明显的杀伤作用(IC50= 0.02 μg/m l),而对另外两种细胞几乎无毒性作用(IC50> 200μg/m l).20 μg/m lGCV 作用96 h 后,仅存在20% 的BGC-HytK 就可使周围的大部分HSV-tk- 的肿瘤细胞死亡,说明存在较显著的“旁观者效应” 相似文献
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本文报道以人Epstein-Barr病毒的潜代膜蛋白基因BNLF-1作为目标基因,插入至逆转录病毒载体pZipNeoSV(x)的克隆位点上,由此获得重组逆转录病毒载体pZipNeoSV(x)-LMP及其反义载体pZipNeoSV(x)-anti-LMP,通过质粒DNA的电转染和G418培养基筛选,然后对10个抗性克隆进行基因整合分析、获得6个含MLV-LTR/BVLF-1融合基因的阳性克隆,采用N 相似文献
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腺病毒载体介导的肝癌细胞专一性自杀基因表达 总被引:5,自引:0,他引:5
构建由肝癌细胞专一的afp基因表达调节元件控制自杀基因HSV-tk的穿梭质粒,将它与缺陷型腺病毒载体重组,得到AdrAFPTK病毒。经PCR及Southern杂交等证实它们含afp元件和tk基因。空斑形成试验表明病毒效价达1×1015pfu/L。同时构建由CMV启动子控制tk基因的类似载体作为对照。将这两个重组腺病毒分别感染AFP阳性(HepG2)或阴性(HeLa,BRL-3A)细胞株(m.o.i.=100),以丙氧鸟苷(ganciclovir,GCV)处理后,用MTT法测定杀伤细胞的效应。结果,AdCMVTK感染这三种细胞后,GCV半杀伤浓度分别为1.3、2、<1μmol/L;但是,AdrAFPTK感染的HeLa和BRL-3A细胞的GCV半杀伤浓度都>1000μmol/L,而对HepG2细胞只有<1μmol/L,表现出极高的细胞专一性。重组腺病毒AdrAFPTK可望用于肝癌的专一性基因治疗 相似文献
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本文报道以人Epstein-Barr病毒的潜伏膜蛋白基因BNLF-1作为目标基因,插入至逆转录病毒载体pZipNeoSV(x)的克隆位点上,由此获得重组逆转录病毒载体pZipNeoSV(x)-LMP及其反义载体pZipNeoSV(x)-anti-LMP,通过质粒DNA的电转染和G418培养基筛选,然后对10个抗性克隆进行基因整合分析,获得6个含MLV-LTR/BNLF-1融合基因的阳性克隆,采用Northern杂交及Western印迹证明,在克隆细胞中表达了2.6kb的mRNA片段及相应的蛋白质分子,这是由BNLF-1基因的EDL1启动子表达的产物。 相似文献
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汉滩病毒核壳蛋白(NP)在杆状病毒系统的表达及其免疫原性研究 总被引:11,自引:0,他引:11
应用杆状病毒表达载体成功地表达了汉滩病毒76-118株(HTNV)核壳蛋白,将HTNVS基因插入杆状病毒转染质粒pAcYMIB的多角体基因启动子下游附近,与经Bsu361酶切线性化的杆状病毒(AcVEPA)DNA共同转染S19细胞,经空斑筛选获得了高效表达NP的重组杆状病毒(AcVHanS)。经SDS-PAGE和Western blot证实,表达产物与HTNV毒粒NP分子量均为50KD左右,紫外扫 相似文献
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Epstein—Barr病毒反义LMP1基因对鼻咽癌细胞CNE2株生长的抑制 总被引:3,自引:0,他引:3
将0.6kbLMP1前段基因反向插入逆转录病毒载体(pZIP)中,构建成pZIP-反义LMP1载体,再转入PA317包装细胞中,用G418筛选性克隆,获得产生1.7×10^5(CFU/ml)反杂交实验证实pZIP-反义LMP1载体基车整合到CNE2细胞的DNA中,并且有载体基因RNA的表达,观察反义LMP1基罟对CN#2细胞生长的影响,发现反义LMP1基因可降低细胞生长速度,减弱CNE2细胞在这果 相似文献
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含人TNF-α、IL-2及NeoR基因多顺反子逆转录病毒载体的构建及表达 总被引:1,自引:0,他引:1
利用脑炎心肌炎病毒和脊髓灰质炎病毒的内核糖体进入位点,连接人TNF-α及IL-2cDNA和选择基因新霉素磷酸转移酶基因(NeoR),使TNF-α、IL-2及NeoR基因均受控于病毒LTR启动子,将这3个基因转录至同一mRNA,从而构建成含人TNF-α、IL-2及NeoR基因多顺反子逆转录病毒载体pGCEN/TRI。在LipofectAMINE介导下将其导入包装细胞PA317,G418筛选得单克隆,病毒滴度为5×105CFU/ml重组病毒分泌的细胞株,经PCR证明外源基因已整合至基因组,Northern印迹显示出单一转录本。用重组病毒上清感染不同的细胞,G418筛选所获得的抗性克隆能不同程度地表达TNF-α及IL-2。实验结果表明,含IRES的多顺反子逆转录病毒载体能很好地在同一靶细胞中表达多个外源基因。 相似文献
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erbB-2与胃癌细胞恶性表型及其增殖调控的关系 总被引:3,自引:1,他引:2
应用基因重组、基因转染、Southern杂交、Northern杂交、细胞生长曲线测定及裸鼠成瘤观察了反义erbB-2逆转录病毒重组载体的转染对人胃癌细胞中erbB-2过度表达的影响及其对EGF的反应性.研究结果显示,erbB-2的表达被其反义重组子特异抑制,伴有细胞增殖能力的下降及致瘤性的下降;在EGF的刺激下,erbB-2高表达肿瘤细胞生长速度提高的幅度显著大于erbB-2反义重组载体转染细胞;EGF促细胞增殖及促基因表达的功能在erbB-2反义重组子转染后受到抑制,提示erbB-2在细胞增殖调控中具有重要功能. 相似文献
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本文报道以人adr亚型HBV DNA(3.2kb)为模板,经多聚酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增X基因片段(949bp),以逆转录病毒体fPGV1为运载体,在它的克隆位点上插入X基因片段,由此获得逆转录病毒重组体fPGV1-X,并同时以含反向X基因顺序fPGV1-anti-X及fPGV1为对照,通过对ψ2及PA317细胞的转染和感染,获得了高于10^4pf 相似文献
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利用脑炎心肌炎病毒的内核糖体进入位点连接人TNF-αcDNA和选择基因NeoR基因,使TNF-α及NeoR基因均受控于病毒LTR启动子,将两基因同时转录至同一mRNA,从而构建成人TNF-α双顺反子逆转录病毒载体pGCEN/TNF-α.在LipofectAMINE介导下将其导入包装细胞PA317,G418筛选得单克隆,病毒滴度为106CFU/ml重组病毒分泌的细胞株.经PCR证明外源基因已整合至细胞基因组,Northern印迹显示出单一LRT转录本.持续G418筛选能明显促进目的基因TNF-α的表达.用重组病毒上清感染小鼠成纤维细胞NIH3T3,G418筛选获得的混合抗性克隆持续高表达TNF-α,40Gyγ线照射后能维持高效表达至7d.实验结果表明,含IRES的双顺反子逆转录病毒载体将是一个很好的基因转移载体. 相似文献
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目的:构建含Ubc9的逆转录病毒表达载体,筛选建立携带该基因的高滴度产毒细胞系,深入研究SUMO化修饰的作用。方法:聚合酶链反应(PCR)扩增获取目的基因Ubc9,定向插入逆转录病毒表达载体pMSCVneo,形成重组质粒pMSCV-Ubc9;脂质体法将pMSCV-Ubc9转染逆转录病毒包装细胞PT67;G418筛选产毒细胞克隆,扩大培养产毒细胞克隆,收获病毒感染NIH3T3细胞。结果:限制性酶切和测序鉴定证实Ubc9正确插入逆转录病毒表达载体。G418筛选获得稳定产毒的抗性细胞克隆,收获病毒能有效感染NIH3T3细胞。结论:携带Ubc9基因的重组逆转录病毒表达载体pMSCV-Ubc9构建成功,转染PT67细胞后包装出重组逆转录病毒,进而筛选获得了能转录表达Ubc9的产毒细胞系PT67-Ubc9。 相似文献
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表达新城疫病毒F48E8株融合蛋白基因的重组鸡痘病毒及其免?… 总被引:11,自引:0,他引:11
将将城疫病毒(NDV)F48E8株融合蛋白基因导入鸡痘病毒(FPV)插入载体pEGF1175-1的P7.5启动子下游,得到转移载体pFG1175-1重组质粒。采用脂质体转染技术,将该质粒转染FPV282E株感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)。,经过多次蓝斑筛选纯化,获稳定的重组病毒rFPV-NDF。间接免疫荧光试验表明,rFPV-NDF感染的CEF中表达了NDV的融合蛋白。用rFPV-NDF免疫的SF 相似文献