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1.
大鼠肝tRNA^Ile基因的克隆与体外转录 总被引:1,自引:1,他引:0
采用PCR扩增出大鼠肝tRNA^Ile基因,构建了重组质粒pGWIW,并用T7RNA聚合酶/启动子系统对其进行了体外表达。经过对转录产物片段大小及运用Northermblot鉴定,证明了获得了不含修饰核苷酸的大鼠肝tRNA^Ile。生物学活性检测显示:合成基因体外转录产物氨基酰经活性是天然tRNA的40%,提示修饰核苷酸在哺乳动物Ile-tRNA合成酶的识别过程中起重要作用。 相似文献
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由于精胺(spermine)能特异地刺激哺乳动物tRNA~(Ile)的氨基酰化,本文用纯化的牛肝tRNA~(Ile)观察了精胺和Mg(2+)对tRNA~(Ile)CD光谱的影响。结果显示:Mg(2+)可使牛肝tRNA~(Ile)CD光谱峰向短波方向偏移2nm,波峰为263nm,峰值被增大约10%,ΔθMg(2+)=2.3×103deg·cm2/dmol;而精胺使牛肝tRNA~(Ile)CD光谱峰减少40%,Δθspermine=1×10(-4)deg·cm2/dmol;精胺和Mg(2+)对肝tRNA~(Ile)-IleRS复合物或IleRS的CD光谱基本无影响。表明Mg(2+)和精胺可影响牛肝tRNA~(Ile)的构象。实验同时以酵母tRNA(Phe)和E·colitRNA~(Ile)作为对照。 相似文献
3.
精胺对牛肝tRNA^lle氨基酰化的刺激作用 总被引:3,自引:0,他引:3
本实验用纯化的牛肝异亮氨酸tRNA(tRNA^Ile)和异亮氨酰tRNA合成酶,研究了精胺对Ile-tRNA复合物形成及IleRS活性的作用。结果表明:精胺能特异地促使牛肝tRNA^Ile氨基酰化反应;对IleRS活性无影响;能明显地增加形成Ile-tRNA复合物反应的Vmax和tRNA^Ile的Km值。 相似文献
4.
精胺和Mg^2+对tRNA^Ile圆二向色谱的影响 总被引:2,自引:0,他引:2
由于精胺能特异异地刺激哺乳动物tRNA^Ile的氨基酰化,本文用纯化的牛肝tRNA^Ile观察了精胺和Mg^2+对tRNA^IleCD光谱的影响。结果显示:Mg^2+可使牛肝tRNA^IleCD光谱峰向短波方向偏移2nm,波峰为263nm,峰值被增大约10%ΔθMg^2+=2.3×10^3deg.cm^2/dmol;而精胺使牛肝tRNA^IleCD兴谱峰减少40%,Δθspermine=1×10^ 相似文献
5.
构建了3种来源于水稻、人和啤酒酵母的线粒体tRNA^Trp基因。实验表明这些线粒体tRNA^Trp的体外转录产物具有被枯草杆菌色氨酰-tRNA合成酶(TrpRS)氨酰化的能力,但是不能被鼠肝来源的氨酰tRNA合成酶粗酶所催化。动力学资源常数测定表明枯草杆菌TrpRS对线粒体tRNA^Trp的亲和力为野生型tRNA^Trp的一半,而在催化效率上,水稻和啤酒酵母线粒体tRNA^Trp的色氨酰化能力比野 相似文献
6.
败血症大鼠心肌肌浆网phospholamban蛋白磷酸酶活性的变化 总被引:3,自引:1,他引:2
用DEAE-Sephacel层析法部分纯化了大鼠心肌肌浆网phospholamban(PLB)蛋白磷酸酶(PPase),并证明其是PPase-1。在SDS-PAGE电泳放射自显影上证明,ES大鼠心肌SR部分纯化的PLBPPase对底物^32P-磷酸化酶a和^32P-SR)的去磷酸化作用明显减弱;LS大鼠该部分纯化的PPase对底物的去磷酸化作用和健康大鼠相比未见明显变化。测定败血症大鼠心肌SR及其 相似文献
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肝刺激因子对人肝癌细胞BEL—7402p21^ras表达的影响 总被引:2,自引:2,他引:2
从雄性初断乳SD大鼠肝匀浆中提取肝刺激因子(HSS)并加以部分纯化,观察其促人肝癌细胞增殖活性及对p21^ras蛋白表达的影响。结果表明:⑴HSS具有明显的促人肝癌细胞增殖活性,其分子量为14-20kD;⑵HSS可提高p21^ras蛋白表达,具有时间-效应关系,并与EGF呈协同作用;⑶HSS调节p21^ras蛋白表达具有剂量-效应关系,且呈现出饱和性。鉴于我们已报道HSS上调EGF受体蛋白和基因表 相似文献
8.
牛生长激素释放因子的融合表达及其产物的化学加工 总被引:2,自引:0,他引:2
通过寡核苷酸引导的定位突变,在人工全合成的第27位为Ile的牛生长激素释放因子[Ile27]bGRF(1-44)OH基因的5'端ATG后插入Trp密码子序列,并分别了构建了Pl promoter控制下、以β-半乳糖苷酶和protein A结合IgG domainB、C为载体蛋白的融合型基因表达质粒pBLE310和pBLPAE2D,在大肠杆菌中得到高效表达。经SDS-PAGE分析,表达产物β-Gal 相似文献
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一个高效表达,快速纯化大肠杆菌精氨酰—tRNA合成酶的 … 总被引:1,自引:0,他引:1
编码大肠杆菌精氨酸-tRNA合成酶的基因argS被克隆到pMFT7-5载体上。将此质粒转化的大肠 力JM109(DE3)中,该转化子粗抽液的比活是宿主菌的2500倍。通过DEAE-Sepharose CL-6B FastFlow和BlueSepharose CL-6B两步柱层析在一天内即可将精氨酰-tRNA合成酶纯化至电泳一条带,比活为36000u/mg,总收率可达69%。 相似文献
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Nm23-H1/NDPK-A基因在大肠杆菌中的高效表达及产物纯化的研究 总被引:15,自引:1,他引:14
利用聚合酶链反应(PCR)技术扩增人二磷酸核苷激酶A亚基(NDPK-A)基因,即nm23-H1/NDPK-K基因的编码序列,经序列分析后,定向克隆于表达质粒载体pBV220,在大肠杆菌DH5α中高效表达出重组人NDPK-A.表达产物为可溶性的非融合蛋白,占菌体总蛋白42%.斑点ELISA法鉴定表明表达产物与NDPK-A标准抗血清呈阳性反应.以DEAE纤维素弱阴离子交换层析、CibacronBlue染料亲和层析结合高效液相排阻色谱技术纯化rNDPK-A,得纯度为96.7%的目标蛋白.以反相高效液相色谱法进行酶活性分析,表明纯化的rNDPK-A能催化ATP+UDP=ADP+UTP的反应,比活性为800U/mg蛋白. 相似文献
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编码大肠杆菌(E.coli)精氨酰-tRNA合成酶(ArgRS)的基因(argS)和编码亮氨酰-tRNA合成酶(LeuRS)的基因(LeuS)分别插入pUC18后,各自在E.coli TG1转化子中的表达有很大的差异(高表达倍数分别为1000和35倍)。为了调查造成其表达差异的原因,用argS的5'上游非编码区取代leuS的5'上游非编码区,构建了融合基因parg-leuS;将它插入质粒pUC18 相似文献
13.
用蛋白质工程方法改变葡萄糖异构酶最适pH和最适温度 总被引:3,自引:2,他引:3
用寡核苷酸诱导的定点突变方法构建了葡萄糖异构酶基因的突变体(N184D和A198C)。含突变体的重组质粒pTKD-GI1(N184D)和pTKD-GI2(A198c)在E.coliK38菌株中表达,用DEAE-Sepharose FF和Sephacryl S-300HR柱层析分离纯化突变酶。与野生型葡萄糖异构酶比较实验表明:(1)突变酶N184D的最适pH值下降了1个单位;等电点下降了0.6个单位 相似文献
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在酵母体内用RNA聚合酶II表达大肠杆菌tRNA^Sec基因 总被引:1,自引:1,他引:0
我们将大肠杆菌的硒代半胱氨酸tRNA基因(SelC基因)连接到分泌型表达质粒PVT102U-αMFL中,并调整好阅读框架,使蛋白翻译的终止密码子位于SelC基因的下游。将该质粒转化酵母,通过SDS-PAGE分析,在SD液体培养基中检测出7 ̄8kd的蛋白条带,这与理论值是相符合的。同时,我们抽提出酵母的总RNA用互补与该tRNA TψC茎环区的21-mer寡核苷酸,经5'标记后作为探针进行North 相似文献
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人PSP基因在昆虫细胞中的高效表达 总被引:2,自引:0,他引:2
应用昆虫杆状病毒表达系统(BES)在昆早细胞Tn-5B1-4中高效表达了人persephin(PSP),SDS-PAGE分析表达量占细胞可深性蛋白质的20%左右,表达产物经Ni^2+-NTA树脂亲和层析纯化后纯度达85%以上。活性研究表明,昆早细胞表达的PSP蛋白能显著促进脊髓神经元的存活。 相似文献
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我们以主往的工作证实成年自发高血压大鼠肠系膜动脉由乙酰胆碱引起的内皮依赖性舒张减弱,为进一步探讨EDR减弱的机制,本文观察了一氧化氮合成酶抑制剂左旋硝基精氨酸及EDRF灭活剂还原型血红蛋白对卒中易感型自发高血压大鼠与常压对照大肠系膜动脉,ACh内皮依赖性舒张的影响,发现L-NNA(10^-3mol/L)可使SHRsp弱于WKY的ACh EDR(10^-8-10^-5mol/L)的差异消失,RHb( 相似文献
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在高表达大肠杆菌精氨酰tRNA合成酶基因550倍的基础上,将arg2的编码起始位点经基因突点突变导入NcoI限制性内切酶的位点后,重组到受异丙基硫代-β-D半乳糖苷诱导的pTr99B质粒上,使argS比受体菌表达高近2000倍。通过一步DEAE-Sepharose柱层析则可得到SDS-PAGE一条带的ArgRS,比活为15000u/mg,与文献相同。 相似文献
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合成的编码大肠杆菌tRNAArg2的基因,嵌入受IPTG诱导启动子控制的质粒pTrc99B中。用上述含目的基因的质粒转化大肠杆菌MT102,得到tRNAArg2基因序列正确的克隆。诱导表达后,与受体菌相比,转化子中的tRNAArg的含量高出10倍,tRNAArg2的含量高出30倍,占总tRNA的70%。DEAESephacel柱层析后,tRNAArg2的纯度即可达到88%。再用benzylDEAEcelulose柱层析可得到纯度为99%、精氨酸接受活力为1600pmole/A260单位的tRNAArg2。从4升过夜培养液中得到的40mg总tRNA。从中可得到18mg纯tRNAArg2,产率为62%。首次精确地测定了精氨酰tRNA合成酶催化tRNAArg2时的动力学常数。 相似文献