安徽庐江鸭乙型肝炎病毒LJ-76转染细胞系的建立

为建立鸭乙型肝炎病毒ＬＪ－７６的转染细胞系,将ＬＪ－７６病毒ＤＮＡ插入到ｐＵＣ１９的ＥｃｏＲⅠ位点上,分离得到含有双拷贝ＬＪ－７６ＤＮＡ的重组质粒．通过磷酸钙沉淀方法,将经ＣｓＣｌ等密度离心纯化的ＬＪ－７６ＤＮＡ双体导入到人肝癌细胞ＢＥＬ７４０２中．收集转染细胞的培养液进行蔗糖密度梯度离心,所得沉淀经检测发现含有ＬＪ－７６ＤＮＡ并具有特异性ＤＨＢＶ内源性ＤＮＡ多聚酶活性;对上述样品通过ＤｏｔＥＩＡ检测ＤＨＢＶ核心抗原及表面抗原结果为阳性．Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析表明转染细胞内存在病毒ＤＮＡ复制中间体ｃｃｃＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ和ｒｃＤＮＡ,而ｃｃｃＤＮＡ被认为是复制活动较为活跃的标志．电镜观察转染细胞的上清发现有病毒颗粒的存在．     

克隆鸭乙型肝炎病毒DNA双体体内转染的研究

用一种含头尾相连DHBVDNA双体的质粒体内转染2日龄芙蓉鸭,大多数鸭（86％）产生了短暂病毒血症。血清DHBs／preSAg和DHBVDNA于转染后第9天出现,第12～14天达峰值,第28天时多数转阴;少数鸭的病毒血症可持续50天以上。转染鸭肝组织中也检测到复制中间型DHBVDNA的存在。用转染鸭病毒血症期的血清作磷钨酸负染电镜观察,找到了完整的DHBV病毒颗粒,并且用此血清腹腔注射1日龄鸭,60％的鸭被感染成功,证明体内转染后有生物活性的DHBV病毒颗粒的产生。该研究方法的建立．对于研究DHBV变异株．DHBV基因结构与功能的关系等,均有一定理论意义及应用价值。     

稳定表达乙型肝炎病毒G145R变异表面抗原细胞系的建立

构建可以在真核细胞表达G145R HBsAg的重组质粒PCI-HBs145。用此质粒转染Hela细胞,经克隆化培养 以及G418筛选,建立稳定表达G145R HBsAg的细胞系。ELISA检测表明表达G145R HBsAg与野生型HBsAg 在免疫反应性上有较大的差异。生物学性状研究结果表明稳定表达G145R HBsAg的2A8细胞纯度好,遗传性状 稳定。     

稳定表达乙型肝炎病毒G145R变异表面抗原细胞系的建立

构建可以在真核细胞表达G145R HBsAg的重组质粒PCI-HBs145.用此质粒转染Hela细胞,经克隆化培养以及G418筛选,建立稳定表达G145R HBsAg的细胞系.ELISA检测表明表达G145R HBsAg与野生型HBsAg在免疫反应性上有较大的差异.生物学性状研究结果表明稳定表达G145R HBsAg的2A8细胞纯度好,遗传性状稳定.     

微量直接法检测鸭乙型肝炎病毒DNA多聚酶

鸭乙型肝炎病毒(DHBV)DNA多聚酶(DNAP)是研究DHBV感染规律和观察药效的敏感指标,但常规方法测定DNAP需用较多量血清并超速离心,不适用于大批标本的检测。本文参照Sprengel介绍的掺入液条件,用微量血清(70～100μl)直接检测鸭血清中的DHBV-DNAP,比常规超速离心法和DHBV-DNA斑点杂交法简便。同时,观察了膦羧基甲酸钠(PFNa_3)对DNAP的抑制作用,以探讨方法的特异性和可行性。     

核酶的体外合成及其对鸭乙型肝炎病毒S基因体外转录物的定点切割

选择鸭乙型肝炎病毒作为核酶的靶病毒,设计针对病毒前基因组Ｓ基因区第１２８８位和１４６９位“锤头状”核酶序列（ＲＺ１和ＲＺ２）。经体外转录及做核酶切割,ＲＺ１和ＲＺ２均有切割作用,以ＲＺ１作用更强。鉴于核酶在相当于鸭体温（４２℃）有切割作用,因此有可能在鸭体内研究其切割作用。     

不同种雏鸭建立鸭乙肝病毒感染模型及抗病毒效果的实验

目的探讨不同种雏鸭建立鸭乙肝病毒感染模型的影响因素,观察应用该模型抗病毒的效果。方法采集鸭血清,应用PCR方法定性检测鸭血清中病毒DNA;定量PCR方法检测鸭血清中病毒DNA载量变化;用抗病毒药物处理,观察其在鸭DHBV感染模型中的抗病毒效果。结果不同种鸭DHBV自然感染率不同,樱桃谷鸭为8.75%,湖北麻鸭两个批次分别为17.80%和10.68%;静脉注射和腹腔注射两途径均能致雏鸭感染DHBV,静脉注射感染率80%,腹腔注射感染率65%;鸭感染DHBV后,体内病毒载量维持在106～108copies/mL,可持续20 d以上;抗病毒药物处理后,在不同DHBV模型中其抗病毒效果变化趋势一致。结论鸭的种类和人工感染途径可影响DHBV感染率;雏鸭感染DHBV后其体内有持续性的病毒血症;DHBV感染模型是药物抗病毒研究较好模型。     

中国安徽庐江鸭乙型肝炎病毒全基因组克隆酶谱分析和部分病毒基因正负单链探针的构建

用鸭乙型肝炎病毒(DHBV)阳性的安徽庐江鸭血清感染DHBV阴性的北京雏鸭,扩增病毒,将提取的DHBV-DNA插入pUC18质粒,转化E.coli JM 105。酶切重组质粒及South-ern转膜杂交结果证实,质粒pLJ76的插入片段为DHBV全基因组。用EcoR Ⅰ等11种限制性内切酶对pLJ76进行酶谱分析,并与美国,西德的已知DHBV基因组比较。定向克隆该株病毒不同基因编码区片段,构建正负单链探针,将斑点杂交和单链电泳检出的M13阳性重组子与已知序列的DHBV基因组作比较,提示获得了该株病毒基因组的S、Pre-S、P和X/C等蛋白编码区的正、负单链克隆株。     

乙型肝炎病毒转染哺乳动物方法的研究进展

本文就目前乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）体内转染哺乳动物细胞,建立肝炎研究动物模型的方法如：转基因动物形成、转染细胞体内移植、经载体携带或裸ＤＮＡ直接注射等,以及存在的问题、前景与展望作一综述。     

鸭圆环病毒与鸭Ⅰ型肝炎病毒二重 PCR 检测方法的建立

目的：建立一种同时检测鸭圆环病毒（DuCV）和鸭I型肝炎病毒（DHV）病原体的二重PCR技术。方法：根据DuCV和DHV的基因文库,分别设计了2对与DuCV和DHV某段基因序列互补的引物,用这2对引物对同一样品中DuCV和DHV模板进行二重PCR扩增。结果与结论：用建立的方法均同时得到了2条特异性的大小与实验设计相符（DuCV：245bp;DHV：569bp）的二重PCR扩增带,而且对其他禽病病原的PCR扩增结果均为阴性,能同时检出56Pg的DHVRNA模板和6Pg的DuCVDNA模板。     

稳定表达乙脑病毒结构蛋白的细胞系的建立

以乙型脑炎病毒SA14-14-2疫苗株全长基因组克隆质粒pBR-JTF为模板,通过PCR分别扩增prM-E及C-prM-E基因片段,构建表达乙型脑炎病毒结构蛋白的真核表达质粒pCJE-ME及pCJE-CME。将这2种重组质粒用脂质体法转染BHK-21细胞后,质粒pCJE-ME表现明显的细胞毒性,转染细胞不能存活;质粒pCJE-cME可导致筛选到表达JEV结构蛋白的稳定细胞系,这种稳定表达JEV结构蛋白的细胞系通过PCR扩增细胞系基因组、ELISA、Western Blot、间接免疫荧光等方法得到鉴定。研究结果表明在C蛋白存在下,乙型脑炎病毒C-prM-E蛋白可以在BHK细胞中稳定表达,为研制JEV新型复制子颗粒疫苗提供了便利工具。     

一种可高效转染的青鳉肌肉细胞系的建立与应用

在哺乳动物细胞系中转基因的效率相对较高而在鱼类细胞系中相对较低, 为了获得鱼类高效转基因细胞系, 我们从模式鱼类青鳉(Oryzias latipes)中分离和构建了肌肉细胞系OLM。该细胞系类似于纤维细胞, 在28℃ DMEM和10%的胚胎牛血清中培养了超过88代。通过染色体分析, 它属于两倍体并含有48条染色体。在脂质体介导下, 报告基因的转染效率可以达到40%, 在测试的其他鱼类细胞中转染效率最高。此外还构建了稳定转染转基因或者非编码RNA的细胞系。OLM细胞对常见的病毒SVCV、GCRV、SGIV等不敏感。综上所述, 研究在青鳉中建立了一种能高效转染的肌肉细胞系, 它适用于鱼类瞬时和稳定的转基因研究。     

乙型肝炎病毒的分型研究

乙型肝炎病毒(HBV)可按两种方法分型:血清型和基因型,目前国内外分型研究表明HBV的基因型具有一定的地域分布特点,并且临床表现、预后、治疗效果与基因型的关系密切。对HBV分型的研究,有利于了解HBV分布传播的规律、探讨HBV的致病机制、提示预后等,是目前乙肝研究的热点之一,本文将对国内外乙型肝炎病毒的分型研究进行综述。     

异羟基洋地黄毒甙元(Digoxigenin)标记的探针在乙型肝炎病毒核酸杂交中的应用

应用异羟基洋地黄毒甙元标记的探针,检测了人和鸭的血清及肝脏中的乙型肝炎病毒核酸,并与~(32)P标记的同位素探针做了比较。结果证明,该探针的特异性和敏感性与同位素探针一致(0.2pg)。它可用于各种核酸杂交试验,如打点杂交、Southern和Northern转印杂交试验等。恰当地从标本中提取待测核酸,是应用该探针的重要条件。     

基于滚环扩增的鸭乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA检测方法的建立

滚环扩增(RCA)是新近发展起来的一种能特异性扩增环形DNA的实验技术,自2008年以来被广泛用于HBV基因全长扩增及共价闭合环状DNA(cccDNA)耐药突变分析等研究。为了便于鸭乙型肝炎病毒(DHBV)cccDNA的分析,本研究建立了基于RCA的DHBV cccDNA的检测方法。通过针对DHBV高度保守序列设计的4对RCA硫化修饰引物,以血清DHBV DNA为阴性对照,从肝组织DHBV DNA标本中扩增得到DHBV cccDNA。然后用跨缺口引物扩增RCA产物测序替代限制性内切酶切分析进行DHBV cccDNA鉴定。应用该方法检测39份携带DHBV麻鸭肝组织与血清标本结果显示:全部肝组织标本均检出DHBV cccDNA,而全部血清标本则均无DHBV cccDNA检出,表明本研究建立的基于RCA的DHBV cccDNA检测法具有良好的特异性和灵敏性。该方法的建立为应用鸭乙型肝炎病毒动物模型研究cccDNA在病毒致病机制中的作用以及评价抗病毒疗效奠定了实验基础。