白桦APETALA2基因启动子的克隆及其表达分析

APETALA2（AP2）转录因子亚家族普遍存在于植物中,参与植株的生长发育、胁迫应答和多种生理生化反应的信号传导。本研究从白桦（Betula platyphylla Suk.）基因组中克隆了AP2基因2 308 bp的启动子序列,生物信息学分析发现,该序列除具有TATA-box和CAAT box等高等植物普遍具有的保守元件外,还具有大量光响应元件和激素响应元件,如响应赤霉素、脱落酸、茉莉酸甲酯等的元件。将白桦AP2基因启动子克隆至pBI121-35S：：GUS植物表达载体中,命名为pBI121-proAP2：：GUS,用农杆菌介导法侵染白桦和拟南芥,并进行GUS染色分析,结果表明AP2基因启动子驱动下的GUS报告基因在整个拟南芥中都表达,在白桦的营养器官和雌花种翅及花柄中也有表达,说明其具有启动活性,可能参与该器官的发育。     

白桦BpPIN5基因启动子组织定位及外源激素应答分析

PIN家族蛋白作为IAA的极性输出载体,在植物胚胎发育、器官发育和向性生长,尤其是植物叶序、叶脉的形成及维管组织分化过程中起关键作用。为了明确白桦（Betula platyphylla）BpPIN5基因对外源激素的应答特性,实验以白桦全基因组DNA为参考,克隆获得BpPIN5基因的上游1 447 bp启动子序列,采用PLACE在线软件对该序列含有的顺式作用元件进行预测,结果表明,BpPIN5启动子序列含有生长素（IAA）、赤霉素（GA）、水杨酸（SA）、脱落酸（ABA）、茉莉酸甲酯（MeJA）、乙烯（ET）等不同类型的生长素响应元件。实验构建了pro-BpPIN5：：GUS载体进行白桦转基因,GUS组化染色分析显示,BpPIN5启动子在白桦叶裂顶端、细叶脉及根中有转录活性。分别用IAA、GA、MeJA、SA及ABA激素处理转基因白桦,结果显示,BpPIN5启动子对上述5种激素在白桦第1叶片的裂叶边缘、第2叶的叶柄及根组织部位均有应答,且响应变化基本一致。研究结果为揭示白桦BpPIN5基因功能提供参考。     

胡杨PeNAC121基因启动子的分离鉴定和胁迫应答模式分析

为了探究NAC转录因子家族成员在胡杨（Populus euphratica）逆境胁迫中的响应和调控机制,利用PCR技术从胡杨中克隆了PeNAC121基因的启动子序列,并采用生物信息学工具对该启动子的结构特征进行了分析,最后利用该启动子驱动GUS报告基因在三倍体毛白杨（Populus tomentosa）中表达,并对获得的转基因植株采用不同胁迫处理后进行了GUS染色和酶活性定量分析。结果表明,克隆获得的PeNAC121基因的启动子长度为1 997 bp（起始密码子ATG上游）,启动序列中除了含有大量的光响应元件,还含有多个与非生物逆境胁迫和激素响应相关的元件,如低温响应元件LTR、干旱响应元件MBS、防卫和胁迫响应元件TC-rich repeats、脱落酸（ABA）响应元件、以及赤霉素（GA）响应元件等。基因的组织表达模式检测结果显示,PeNAC121基因主要在茎中表达,在根和叶中的表达较少。GUS组织化学染色和酶活性检测结果表明,胡杨PeNAC121启动子显著受到NaCl、甘露醇、ABA和4 ℃低温的诱导表达。由上述结果推测PeNAC121基因与胡杨的逆境胁迫应答密切相关,表明该基因的启动子是一个能够应答多种逆境胁迫的诱导型启动子。本研究为阐明PeNAC121基因在胡杨逆境响应和调控中的作用机制提供理论参考。     

白桦BpJMJ18基因启动子克隆及表达分析

为探究BpJMJ18基因在植物生长发育过程中的功能，本研究利用PCR技术克隆白桦（Betula platyphylla）BpJMJ18基因的启动子，通过生物信息学分析发现，该启动子序列中除了包含TATA-box和CAAT-box等基本顺式作用元件外，还具有光响应元件和多种激素应答相关的元件；进而构建植物表达载体pBI101-BpJMJ18pro：：GUS，并用农杆菌介导的瞬时转化法侵染白桦，对转基因株系进行GUS染色分析，结果发现BpJMJ18基因启动子能够驱动GUS基因在白桦的主根、侧根、根尖、叶片的维管束和嫩茎中均检测到表达。上述结果说明白桦BpJMJ18启动子具有启动活性，可能影响植物的生长发育。     

拟南芥AtNCED2基因启动子区域序列克隆及其活性分析

目的:克隆拟南芥AtNCED2基因启动子区域序列,并分析其组织器官特异性及对外界刺激的响应.方法:通过PCR从拟南芥基因组中克隆AtNCED2基因5'侧翼2295bp启动子区域序列(AtNCED2p),并进行生物信息学分析.构建AtNCED2p驱动GUS的植物双元表达载体pAtNCED2p::GUS,通过根癌农杆菌介导法将其转化野生型拟南芥,检测转基因植侏中GUS表达的组织器官特异性.结果:该启动子序列中存在TATA-box、CAAT-box、根器官特异性元件、ABA响应元件、低温响应元件、昼夜节律响应元件等顺式作用元件.GUS活性主要集中在转基因拟南芥根尖及侧根发生部位.外源ABA处理的转基因植株根中GUS活性为174.8nmol 4-MU min-1 mg-1蛋白,明显高于对照值91.7nmol 4-MU min-1mg-1蛋白.结论:AtNCED2基因可能在根的生长和发育中起作用,且外源ABA处理增强其在根中的表达.     

白桦BpSPL2基因启动子的克隆及表达分析

SPL(SQUAMOSA promoter-binding protein-like)是植物特有的转录因子,研究表明其在参与发育阶段转变、花和果实发育等方面起着重要作用。利用PCR技术从白桦基因组DNA中扩增获得BpSPL2基因上游1 960 bp启动子序列,使用PLACE和Plant CARE在线软件分析序列,发现BpSPL2基因启动子序列中含有与开花、非生物胁迫及激素响应等相关的顺式作用元件,暗示其在植物的生长发育和胁迫应答中起重要作用。进而构建了BpSPL2基因启动子驱动GUS报告基因的植物表达载体,并利用农杆菌介导将其瞬时转化至白桦和拟南芥,通过GUS组织化学染色检测BpSPL2基因启动子的组织表达特性,结果表明BpSPL2基因启动子具有启动子活性,能够驱动GUS基因在白桦和拟南芥中表达;而其表达活性在白桦的叶片、芽及根部中较强,在拟南芥的花药、雌蕊和叶片较强,为进一步研究白桦BpSPL2基因的表达调控及其功能分析提供参考。     

普通野生稻绿色组织特异表达启动子的克隆与鉴定

绿色组织特异表达启动子可调控外源基因只在受体作物的绿色组织中定点、高效地表达。以普通野生稻为实验材料,克隆了绿色组织特异表达启动子Or GSP,构建Or GSP和GUS基因融合的表达载体,转入拟南芥中鉴定功能。启动子Or GSP长度为825 bp,含有基本的转录起始元件TATA-box和CAAT-box,以及光响应元件TCCC-motif、Sp1、G-box、I-box、GA-motif和as-2-box等。转基因拟南芥GUS组织化学染色结果表明,启动子Or GSP调控GUS基因只在绿色组织中特异表达。GUS活性测定结果显示,叶和茎中的GUS活性比根中明显提高。普通野生稻中克隆的启动子Or GSP为绿色组织特异表达启动子,可为作物分子育种提供新的调控元件。     

84K杨PagC3H3基因表达模式分析

木质素作为木材的主要组成成分,通常是由3种单体聚合而成,在其生物合成过程中,共有10个酶家族参与负责将苯丙胺酸转化为单体木质素,其中C3H是在对-香豆酰辅酶A（p-coumaroyl CoA）到咖啡酰辅酶A（caffeoyl CoA）的羟基化过程和G/S单体形成中的关键控制酶类,探究PagC3H3基因表达模式,对于进一步了解该基因功能具有重要意义。该研究通过定量PCR对PagC3H3基因的组织特异性表达进行分析;克隆得到了长度为2 035 bp的PagC3H3的启动子序列,预测含有多个顺式作用元件;同时,将获得的PagC3H3的启动子序列构建植物表达载体pBI121-PagC3H3pro：：GUS,进行拟南芥瞬时转化,结果显示PagC3H3基因在84K杨的根、中部茎节和基部茎节中的表达量较高;瞬时转化拟南芥,GUS染色表明：在下胚轴和根中GUS活性较强,由此推测PagC3H3基因在木质素合成过程中发挥作用。     

中间锦鸡儿CiNAC038启动子的克隆及对激素响应分析

NAC转录因子家族是植物中特有的、家族数目较多的一类转录因子家族,对植物生长发育起重要作用。了解CiNAC038的表达调控分子机制,为中间锦鸡儿CiNAC038功能研究奠定基础。以中间锦鸡儿为植物材料,通过染色体步移法克隆启动子序列,并对启动子序列上的响应元件进行分析。构建GUS表达载体,并转化拟南芥,对拟南芥的组织特异性进行表达分析,用ABA诱导转基因植株,研究ABA与CiNAC038的关系。结果显示,克隆了1 800 bp的CiNAC038启动子序列,该启动子包含多种顺式元件。成功构建植物表达载体ProCiNAC038∶GUS,通过浸花法转化至野生型拟南芥。GUS组织化学染色结果显示,转基因拟南芥幼苗根部染色较深,胚轴无染色;成熟期转基因拟南芥的叶脉、果荚两端、花瓣、花药等组织染色较深,茎无染色。CiNAC038启动子驱动的GUS报告基因主要在植物叶片、根和花的组织器官表达。进一步ABA诱导表达分析发现,GUS染色随着浓度增加颜色越浅。CiNAC038启动子是ABA抑制型启动子。     

白桦BpBEE1基因启动子的表达特性分析

Brassinolide Enhanced Expression1（BEE1）基因属于bHLH转录因子家族,是调控油菜素内酯信号转导的重要元件。本研究克隆了BpBEE1基因的启动子,通过生物信息学对启动子顺式作用元件进行分析发现：BEE1启动子序列中含有与多种激素应答相关的元件;对转Promoter-BEE1基因拟南芥株系进行组织特异性染色和激素处理,结果表明：转基因株系中GUS染色在叶脉和根系中染色较深,MeJA、SA、BL和ABA处理后GUS活性增强,尤其是MeJA、SA、BL处理后的GUS染色最深。以上结果说明白桦BpBEE1基因参与激素应答等生物学过程,并对植物的生长发育有一定的调控作用。     

白桦BpPIN3基因启动子序列及应答特性分析

PIN蛋白家族作为植物中重要的生长素外排载体家族,在植物生长和发育过程中表现出广泛的生理效应。为了进一步了解BpPIN3的功能,探究其在白桦（Betula platyphylla）发育过程中及其对不同激素信号和非生物胁迫的响应,采用生物信息学方法分析白桦BpPIN3启动子序列。以1年生和2年生白桦无性系苗木的根、茎、叶和顶芽为材料进行组织部位表达模式分析。以白桦幼苗为材料,用100 μmol·L^-1生长素（IAA）、100 μmol·L^-1赤霉素（GA₃）、200 μmol·L^-1脱落酸（ABA）和长光照条件下分别进行激素诱导和光胁迫处理,并取激素处理后0、2、4、8、16、24、48 h以及光胁迫后0、1、3、6,12、24、48、72 h时的白桦叶片和根提取RNA,利用qRT-PCR技术分析BpPIN3基因的表达情况。结果显示：BpPIN3启动子序列包含赤霉素、脱落酸、茉莉酸甲酯等不同类型的生长素响应元件,以及多个与逆境相关的顺式调控元件。BpPIN3在不同生长年份白桦的多个组织部位都有表达,尤其在叶片中表达量较高,并且所有组织部位中BpPIN3第二年的表达量均高于第一年。BpPIN3基因在不同处理条件下,不同部位间的相对表达量的变化存在一定差异,IAA及GA能够诱导白桦叶片组织细胞中的BpPIN3上调表达;而在ABA处理下除16、48 h外,BpPIN3基因表现出与IAA处理下相反的表达模式。在根组织中,IAA、GA₃及ABA均能诱导BpPIN3的表达。在叶片组织中,遮光胁迫诱导了BpPIN3基因的表达;在根组织中,随着处理时间的推移,12 h开始BpPIN3基因的相对表达量均显著高于对照（0 h）。根据试验结果,推测BpPIN3基因在白桦生长发育过程,以及IAA、GA₃和ABA信号转导途径和植物光响应过程中发挥重要调控作用。     

白桦反义CCoAOMT基因调控木质素生物合成

白桦是我国北方重要的造林树种,但其中的高木质素含量严重制约了它作为造纸资源植物的开发利用。本文利用RACE技术获得了白桦咖啡酰辅酶A-3-O-甲基转移酶（CCoAOMT）基因全长ORF序列,并构建了白桦CCoAOMT基因的反义表达载体,通过农杆菌介导法将其导入到白桦中。PCR检测表明反义CCoAOMT基因已整合到白桦的基因组中。对转化植株的半定量PCR检测显示转基因株系的CCoAOMT基因表达量下降;Wiesner染色发现,与野生型相比,转基因植株木质素含量有所下降。对七年生的转基因白桦和野生型对照进行了化学成分分析,结果表明转基因白桦的苯醇抽提物和Klason木质素显著减少,聚戊糖含量升高。上述结果暗示BpCCoAOMT基因参与白桦木质素的合成,反义表达该基因后木质素含量减少,更易于去除。白桦CCoAOMT基因对木质素的合成起重要作用,这为培育低木质素含量的制浆新品种白桦奠定了基础。     

Functional characterization of a putative nitrate transporter gene promoter from rice

Drought is one of the most significant abiotic stresses that influence plant growth anddevelopment.Expression analysis revealed that OsNRT1.3,a putative nitrate transporter gene in rice,wasinduced by drought.To confirm if the OsNRT1.3 promoter can respond to drought stress,a 2019 bpupstream sequence of OsNRT1.3 was cloned.Three OsNRT1.3 promoter fragments were generated by5′-deletion,and fused to the β-glucuronidase (GUS) gene.The chimeric genes were introduced into riceplants.NRT2019::GUS,NRT1196::GUS and NRT719::GUS showed similar expression patterns in seeds,roots,leaves and flowers in all transgenic rice,and GUS activity conferred by different OsNRT1.3 promoterfragments was significantly upregulated by drought stress,indicating that OsNRT1.3 promoter responds todrought stress and the 719 bp upstream sequence of OsNRT1.3 contains the drought response elements.     

獐茅HAK基因表达调控区的分离及其在水稻中的功能分析

獐茅高亲和性K+转运蛋白基因(AlHAK1)是从单子叶禾本科盐生植物獐茅(Aeluropus littoralis(Gouan)Parl)中克隆,对于细胞营养和离子渗透调节起关键作用。为了进一步了解AlHAK1基因的表达调控机制,文章采用基因组步移法分离了AlHAK1基因转录起始位点上游长度约1.3 kb的启动子区域。启动子顺式元件分析显示该序列具有典型的TATA和CAAT盒,以及一些与植物生长发育和环境响应相关的顺式元件。为了明确AlHAK1启动子的功能,将其与GUS基因融合构建到植物表达载体pCAMBIA1301上,通过农杆菌介导转化法导入水稻中。对转基因植株进行GUS组织化学染色,结果显示在转化AlHAK1启动子水稻的根、茎、叶、花药和内外稃部位均检测到GUS活性。GUS荧光定量分析显示AlHAK1启动子调节GUS表达活性低于组成型启动子CaMV35S和Ubiquitin,但其根部和茎部的GUS活性相对较高。对转化植株进行不同胁迫处理后检测GUS活性,结果表明受到ABA、干旱、高温的诱导后其茎部和根部GUS活性有所提高,推测位于该启动子-682 bp的HSE元件和-1 268 bp的MybBS元件可能在高温、ABA和干旱诱导的表达调控中起作用。     

pib基因启动子及其诱导启动性初探

将pib基因上游5.7 kb区段取代pCAMBIA1301中gus基因上游的35S启动子构建了pib拟启动区-GUS+ 35S-hpt 基因表达载体pNAR604。经农杆菌介导转化水稻成熟胚愈伤,获得了转基因抗潮霉素愈伤和36株转基因水稻植株。 转基因抗性愈伤和转基因植株根的组织化学GUS活性检测表明,光照培养下的抗性愈伤和转基因植株根不能使X-gluc显色,而暗处理24 h后的抗性愈伤和定植后转基因植株的根能使X-gluc显色。转基因植株GUS荧光定量分析结果表明,GUS表达具有器官特异性,黑暗处理前根的GUS活性最高、茎次之,分别是是叶片的7倍和3倍,叶片中仅有痕量本底。24 h黑暗处理后根、茎、叶中GUS活性都有增加,且叶片中的增加比例最大,其活性仅次于根。5 mmol/L水杨酸和0.3 mol/L NaCl叶面喷施转基因植株24 h后叶片中GUS活性分别为处理前的2.7和3.6倍。初步确定pib拟启动区是一个诱导型启动子。黑暗、水杨酸和NaCl能诱导该启动子启动活性。