邻苯二酚1,2-双加氧酶的结构、功能及同工酶现象研究进展

邻苯二酚是芳香族化合物多条生物降解途径中共有的一种重要的中间产物,根据开环方式的不同,可分为邻位降解途径和间位降解途径,其中邻位降解途径中的关键酶是邻苯二酚1,2-双加氧酶。本文主要综述了邻苯二酚1,2-双加氧酶的结构、酶学性质,以及它在芳香烃降解菌中存在的同工酶现象及其功能研究进展。     

基于光谱法-图像灰度法高通量筛选高效固定CO2的苯甲酸脱羧酶*

目的:苯甲酸脱羧酶能够催化羧化反应固定CO₂,为了获得高效的苯甲酸脱羧酶,需要利用高通量分子克隆与突变体筛选系统对产生的大量突变体进行筛选,因此建立、开发高效的筛选评价方法对于获得高羧化效率的突变体至关重要。方法:利用2,3-二羟基苯甲酸脱羧酶催化邻苯二酚固定CO₂的反应体系,建立了光谱法-图像灰度法高通量筛选和评价固定CO₂的苯甲酸脱羧酶突变体。利用分光光度法在308 nm快速定量羧化产物2,3-二羟基苯甲酸。同时利用高效液相色谱(HPLC)法对分光光度法的测定结果进行了校正,确定了分光光度法估算的2,3-二羟基苯甲酸浓度与HPLC方法测定的准确浓度之间具有良好的线性关系(R² = 0.996)。利用HPLC-分光光度法的相关性可以获得实际样品中准确的2,3-二羟基苯甲酸浓度。利用Image J软件获得蛋白质标准品和突变体的灰度均值,根据灰度法定量蛋白质标准品的标准曲线计算突变体的蛋白质表达量。利用单位酶量催化邻苯二酚获得2,3-二羟基苯甲酸的浓度比较突变体的催化活性。结果:纯酶和粗酶体系下HPLC法测定的2,3-二羟基苯甲酸浓度与分光光度法测定的吸光度值的关系分别为C₁=0.500A₁-0.010(R² = 0.996)和C₂=1.458A₂+0.431 9(R² = 0.991)。从13个突变体中获得了两个正向突变体,羧化活性分别是WT的3.5倍和1.7倍。结论:基于光谱法-图像灰度法可以实现高通量筛选固定CO₂的苯甲酸脱羧酶,该方法可用于具有相似功能的苯甲酸脱羧酶对其他取代基的酚类和水杨酸类似物的底物选择性筛选。     

深渊来源Citricoccus sp.strain NyZ702的分离培养及其降解4-羟基苯甲酸的特性

【背景】深渊沉积物中存在丰富的微生物细胞和活跃的微生物碳周转,因此,分离培养微生物资源对于认识深渊中的物质循环、能量代谢具有重要意义。芳香化合物在环境中广泛存在,基于组学分析揭示了深渊中具有潜在的芳香化合物代谢菌株,然而深渊来源的芳香化合物降解微生物纯培养和相关的代谢机理研究仍然缺乏。【目的】从马里亚纳海沟沉积物样本中分离培养具有降解芳香化合物能力的微生物,对其代谢途径、中间产物和降解酶活力进行初步鉴定。【方法】以4-羟基苯甲酸为唯一碳源对马里亚纳海沟沉积物样本中的降解菌株进行分离培养,结合形态观察、16S rRNA基因扩增与序列分析对菌株进行鉴定,通过底物生长实验验证其降解能力,通过高效液相色谱和超高效液相色谱-飞行时间质谱联用仪初步鉴定全细胞生物转化中间产物,利用紫外分光光度计测定其粗酶液催化4-羟基苯甲酸的活力,进而推测菌株降解4-羟基苯甲酸的代谢途径。【结果】从深渊沉积物中分离培养获得一株好氧细菌,16SrRNA基因序列分析显示该菌株隶属于柠檬球菌属(Citricoccus),命名为Citricoccus sp. strain NyZ702。该菌株在LB固体培养基上经30°C培养4 d后呈柠檬黄色、不透明、表面光滑、边缘整齐、凸出于培养基表面、直径约为1-2 mm的圆形菌落。扫描电镜表明菌体呈球形,直径为0.4-0.6μm,无鞭毛结构。该菌株为耐盐菌,最适生长盐浓度范围为2%-8%(质量体积分数)。该菌株可利用4-羟基苯甲酸为唯一碳源进行生长,可转化4-羟基苯甲酸至中间产物原儿茶酸,推测该菌株通过原儿茶酸途径降解4-羟基苯甲酸。菌株NyZ702的粗酶液具有4-羟基苯甲酸单加氧酶活力,对4-羟基苯甲酸的催化反应需要还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)作为辅因子。【结论】从深渊沉积物样本分离得到一株4-羟基苯甲酸降解菌Citricoccus sp. strain NyZ702,该菌株以原儿茶酸为中间代谢产物降解4-羟基苯甲酸,丰富了深渊来源的微生物菌种资源,为深渊中的芳香化合物降解研究提供了一定的理论基础。     

三氯卡班降解菌株Sphingomonas sp. YL-JM2C中多个邻苯二酚双加氧酶的功能

【目的】研究Sphingomonas sp.YL-JM2C菌株的生长特性,确定以三氯卡班作为碳源的生长情况。挖掘菌株YL-JM2C潜在的邻苯二酚1,2-双加氧酶及邻苯二酚2,3-双加氧酶基因,在大肠杆菌(Escherichia coli)中异源表达邻苯二酚双加氧酶基因并研究其酶学性质。【方法】优化S.sp.YL-JM2C菌株以三氯卡班作为碳源时的培养条件,并利用全自动生长曲线测定仪测定菌株生长情况,绘制生长曲线。通过生物信息学方法挖掘潜在的邻苯二酚双加氧酶基因,并分别在Escherichia coli BL21(DE3)中进行异源表达,通过AKTA快速纯化系统纯化蛋白,分别以邻苯二酚、3-和4-氯邻苯二酚为底物检测重组蛋白的酶学特性。【结果】菌株在pH为7.0-7.5时生长最优。在以浓度为4-8 mg/L的三氯卡班做为底物时,菌株适宜生长。当R2A培养基仅含有0.01%酵母提取物和无机盐时,加入终浓度为4 mg/L的三氯卡班可促进菌株生长。挖掘到6个潜在的邻苯二酚双加氧酶基因stcA1、stcA2、stcA3、stcE1、stcE2和stcE3,表达并通过粗酶液分析证明其中5个基因stcA1、stcA2、stcA3、stcE1和stcE2编码的酶均具有邻苯二酚双加氧酶和氯邻苯二酚双加氧酶的活性;纯化酶的底物范围研究揭示了StcA1、StcA2和StcA3均属于Ⅱ型邻苯二酚1,2-双加氧酶,StcE1和StcE2为两个新型邻苯二酚2,3-双加氧酶;它们酶动力学分析研究证明了5个酶对邻苯二酚的亲和力和催化效率最高,4-氯邻苯二酚次之。【结论】在同一菌株中发现了5个具有功能的邻苯二酚双加氧酶基因,stcA1、stcA2和stcA3编码的酶均属于Ⅱ型邻苯二酚1,2-双加氧酶,stcE1和stcE2为两个新型邻苯二酚2,3-双加氧酶编码基因。5个酶均具有催化邻苯二酚和氯邻苯二酚开环反应的功能,这为更好地理解微生物基因组内代谢邻苯二酚及其衍生物氯代邻苯二酚基因的多样性奠定了基础。     

甾体微生物转化反应关键酶3-甾酮-Δ1-脱氢酶的研究进展

3-甾酮-Δ~1-脱氢酶是甾体化合物微生物代谢的关键酶,负责催化3-酮基类甾体化合物A环上的C1,2位脱氢反应。其不仅在甾体母核的早期降解途径中发挥重要作用,而且能通过A环C1,2位上双键的导入显著提高甾体化合物的生理活性。本文详细阐述了3-甾酮-Δ~1-脱氢酶在微生物中的种属分布和序列特征、酶的生物学特性、生理作用、催化机理以及分子改造等,为深入研究该酶在甾体生物转化领域中的应用提供重要参考。     

邻苯二酚2,3-双加氧酶的结构和功能研究进展

邻苯二酚是所有芳香族化合物降解过程中的重要的中间产物,其降解有邻位和间位裂解两条裂解途径,分别由邻苯二酚1,2-双加氧酶(C12O)和邻苯二酚2,3-双加氧酶(C23O)催化裂解。本综述简要介绍了邻苯二酚2,3-双加氧酶的结构和功能的研究进展。     

邻苯二酚-1,2-双加氧酶的催化性质

邻苯二酚-1,2-双加氧酶能催化邻苯二酚的两个羟基之间裂解,生成顺,顺-己二烯二酸,加水很容易转化为尼龙-6,6的原料己二酸。此外,它有极易起化学反应的共轭双键和羧基,可成为新功能树脂的原料。1955年发现邻苯二酚-1,2-双加氧酶,此后进行了大量研究工作,但是直到近几年由于合成顺,顺-己二烯二酸的需要,才引起人们的高度重视。我们对胞外酶产生菌的发酵条件及其所产的邻苯二酚-1,2-双加氧酶性质进行了研究,为工业规模的生产应用作了准备。     

粪便微生物宏基因组来源的热稳定性邻苯二酚1,2-双加氧酶异源表达及酶学性质

【目的】克隆倭蜂猴粪便微生物宏基因组的邻苯二酚1,2-双加氧酶基因cat PLCgl,并对该酶进行异源表达及酶学特性研究。【方法】利用宏基因组高通量测序技术获得cat PLCgl,并对其氨基酸序列进行分析。将cat PLCgl重组到载体p EASY-E2中并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达,研究其酶学性质。【结果】cat PLCgl全长852 bp,G+C含量48%,编码283个氨基酸,理论分子量为33.56 k D。重组Cat PLCgl酶学性质分析显示最适作用p H为7.0,其中在p H 7.0–10.0范围内处理1 h后,酶活剩余90%以上;最适作用温度为40°C,在25°C和40°C条件下稳定性较好,耐受210 h酶活性几乎不变。重组酶在最适条件下的动力学参数K_m、V_(max)和k_(cat)分别为24.9μmol/L、8.3 mmol/(min·g)和13.7 s~(-1);Fe~(2+)、Hg~(2+)、Cu~(2+)、Triton X-100、SDS、Ag+强烈抑制该酶活性,而其它金属离子及有机试剂影响较小。【结论】从倭蜂猴粪便微生物宏基因组中克隆得到邻苯二酚1,2-双加氧酶基因cat PLCgl,并对重组Cat PLCgl酶学性质进行研究,该酶具有较好的热稳定性和耐碱性,在降解环境中的邻苯二酚和生产顺,顺-己二烯二酸方面具有应用潜力。     

不动杆菌3-苯氧基苯甲酸降解基因的克隆与表达

3-苯氧基苯甲酸（3-PBA）作为拟除虫菊酯类农药的非特异性降解中间产物,具有抗雌激素特性,可扰乱生物体内分泌系统,比菊酯类农药迁移更广,半衰期更长,生物毒性更大,是拟除虫菊酯类农药在生物体中暴露的标志。通过构建4-D菌(Acinetobacter sp.)基因组文库,混合池驯化筛选得到4-D菌中降解3-PBA的关键酶基因,其开放阅读框为921 bp,编码306个氨基酸,Genbank登录号为KR024742。经同源比对和酶活验证,证实该酶为邻苯二酚双加氧酶。根据该ORF序列设计引物,引物两端分别加上NdeⅠ和Hind Ⅲ酶切位点,以4-D菌基因组DNA为模板,成功克隆到D34基因序列。构建表达载体pET-21b-D34并转化进宿主大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG（0.1 mmol/L）诱导后,表达重组菌对3-PBA降解率为18.7%。研究结果为3-PBA污染的微生物环境修复提供了理论参考。     

海生杆菌属的基因组测序数据分析

海生杆菌属首次于1997年鉴定,迄今包括18个物种,其中10个已完成全基因组序列测定。文中总结了海生杆菌属的菌种特征,并从碳源利用、聚羟基脂肪酸酯代谢和芳香族化合物降解三个方面对基因组测序数据进行了分析。研究发现,海生杆菌属具有完整的糖酵解途径和三羧酸循环,缺乏木糖利用基因。所有海生杆菌属菌种均含有Ⅰ型和Ⅲ型聚羟基脂肪酸酯合成酶的编码基因,表明该菌属可能具有普遍的聚羟基脂肪酸酯合成能力。海生杆菌属含有芳香族化合物的降解途径,苯、苯酚和苯甲酸可由不同的酶催化生成邻苯二酚,再由邻位断裂途径降解为3-酮己二酸,邻苯二酚也可由间位断裂途径降解为丙酮酸和乙酰辅酶A。基因组测序数据分析加深了对海生杆菌属代谢特征的认识,提示该菌属在聚羟基脂肪酸酯合成和海洋芳香族污染物治理方面有一定的应用前景。     

微生物降解3-苯氧基苯甲酸的研究进展

摘要:3-苯氧基苯甲酸(3-phenoxybenzoic acid,3-PBA)作为大多数拟除虫菊酯类农药的降解产物之一,在自然环境中难以降解,具有雌激素毒性,严重威胁到食品安全及人体健康。微生物对拟除虫菊酯及其中间产物(3-PBA)的降解已成为近年来的研究热点。本文从降解3-PBA的微生物种类、降解酶及降解基因、降解途径等方面进行了综述,对3-PBA生物降解机理、3-PBA降解酶基因工程菌构建的研究方向进行了展望,以期为微生物降解3-PBA的研究提供参考。     

蕨菜多酚氧化酶的酶学性质

研究了蕨菜[Pteridium aquilinum (L．) Kuhn var．latiusculum (Desv．) Underw．]多酚氧化酶的动力学性质,结果表明：以邻苯二酚为底物,该酶最适pH为7．4,最适温度为25℃,60℃以上使酶迅速失活,动力学方程v=619．08[S]/(0．031 [S]),Vc、异Vc钠、NaHSO3、L-Cys可完全抑制酶活性,饱和NaCl能显著抑制酶活性,蔗糖、SDS对酶有激活作用。该酶能催化邻苯二酚、焦性没食子酸氧化,但对焦性没食子酸亲和力更强。     

微生物酶转化合成手性药物的研究进展

通过微生物酶催化不对称合成反应或拆分外消旋体合成医药手性中间体具有独特的优势。结合作者自身近年来在该技术领域的实践对相关课题作了介绍,总结了微生物酶催化不对称反应和拆分反应得到手性药物的研究进展。     

L-异亮氨酸和甘氨酸对大肠杆菌表达与分泌邻苯二酚2,3-双加氧酶的作用

证实了甘氨酸与L-异亮氨酸对大肠杆菌表达邻苯二酚2,3-双加氧酶(CatO_2ase)的促进作用和甘氨酸促使该酶分泌至胞外培养基中的作用.产酶量高低和分泌量多少与培养基种类、甘氨酸和L-异亮氨酸的浓度以及培养时间等因素有关.在甘氨酸存在的情况下,胞壁对溶菌酶的敏感性有所增加,超微形态似有变化,还存在其他物质的伴随分泌,故甘氨酸可能是引起细胞壁结构的改变而导致邻苯二酚2,3-双加氧酶等胞内容物被动分泌至胞外.     

3-苯氧基苯甲酸降解菌Sphingomonas sp. SC-1降解苯酚环境条件及其降解中间产物的研究

【目的】探究高效降解3-苯氧基苯甲酸(3-Phenoxybenzoic acid,3-PBA)的鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.) SC-1对苯酚的降解特性。【方法】采用HPLC测定微生物降解体系中苯酚残留量,考察环境条件对菌株SC-1降解苯酚的影响;分析不同培养时间苯酚降解体系混合样品的HPLC谱图,确定其降解中间产物。【结果】菌株SC-1能在基础盐培养基中以苯酚为唯一碳源和能源生长,在初始pH 7.0、30 °C条件下,24 h可完全降解100 mg/L苯酚;Cu2+、Ba2+、Mn2+等对其降解苯酚有不同程度的抑制作用;HPLC谱图分析,初步确定邻苯二酚是菌株SC-1降解苯酚的中间产物,且该菌株可在48 h内完全降解100 mg/L邻苯二酚。【结论】菌株SC-1对苯酚及邻苯二酚均有较强的降解能力,为完善3-PBA的降解途径及污染3-PBA或含酚废水或含酚农药残留的降解提供了数据参考。     

L-异亮氨酸和甘氨酸对大肠杆菌表达与分泌邻苯二酚2,3-双加氧酶的作用

证实了甘氨酸与L-异亮氨酸对大肠杆菌表达邻苯二酚2,3-双加氧酶(CatO_2ase)的促进作用和甘氨酸促使该酶分泌至胞外培养基中的作用.产酶量高低和分泌量多少与培养基种类、甘氨酸和L-异亮氨酸的浓度以及培养时间等因素有关.在甘氨酸存在的情况下,胞壁对溶菌酶的敏感性有所增加,超微形态似有变化,还存在其他物质的伴随分泌,故甘氨酸可能是引起细胞壁结构的改变而导致邻苯二酚2,3-双加氧酶等胞内容物被动分泌至胞外.     

陶厄氏菌Thauera sp.K11对酚类化合物降解作用及途径研究

旨在分析陶厄氏菌属(Genus Thuaera)中的一株菌株Thauera sp.K11对含酚废水中酚类化合物的降解作用和途径。以石化污水厂分离菌株K11为研究对象,克隆其16S r RNA基因和关键酶基因,并进行系统发育分析,在基因水平探究苯酚降解机理;利用气相色谱技术检测酚类化合物降解效果和苯酚降解机理。结果显示,利用16S r RNA系统学分析发现K11是陶厄氏菌属的一株细菌。该菌对11种酚类化合物具有降解作用,其中5种酚类化合物72 h的降解率90%。克隆并获得了K11的苯酚羟化酶和邻苯二酚双加氧酶基因。酶活性测定表明,K11通过苯酚羟化酶催化苯酚转化为邻苯二酚,然后利用邻苯二酚-2,3-双加氧酶催化产生2-HMSA。陶厄氏菌Thauera sp.K11是一株能够降解多种酚类化合物的菌株,具有较强的酚类污染物降解能力,其通过苯酚→邻苯二酚→2-HMSA途径进行苯酚降解。     

微生物降解石油烃的功能基因研究进展

微生物对石油烃的降解在自然衰减去除土壤和地下水石油烃污染的过程中发挥了重要作用。微生物通过其产生的一系列酶来利用和降解这类有机污染物,其中,编码关键降解酶的基因称为功能基因。功能基因可作为生物标志物用于分析环境中石油烃降解基因的多样性。因此,研究石油降解功能基因是分析土著微生物群落多样性、评价自然衰减潜力与构建基因工程菌的重要基础。本文主要介绍了烷烃和芳香烃在有氧和无氧条件下的微生物降解途径,重点总结了烷烃和芳香烃降解的主要功能基因及其作用,包括参与羟化作用的单加氧酶和双加氧酶基因、延胡索酸加成反应的琥珀酸合酶基因以及中心中间产物的降解酶基因等。     

6-羟基烟酸3-单加氧酶(NicC)催化反应机理研究

恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT2440中的6-羟基烟酸(6HNA)3-单加氧酶(NicC)是烟酸代谢过程中的关键酶。NicC通过在吡啶环上加羟基对吡啶环进行活化,从而使吡啶环可在双加氧酶催化下开环,最终被完全降解。通过去除NicC的N端稀有密码子增加了NicC的表达量,进一步利用Ni-Sepharose重力柱对NicC进行了纯化。通过实验发现,NicC的最适反应温度为30～40℃,最适反应pH为8.0。Cd~(2+)对NicC的酶活有明显的抑制作用。当NADH的浓度为0.25mmol/L时,底物6HNA所对应的NicC的最大酶活为14.1U/mg,K_m值为51.8μmol/L;当6HNA的浓度为0.25mmol/L时,底物NADH所对应的NicC的最大酶活为10.79U/mg,K_m值为15.0μmol/L。通过HPLC和LC-MS分析表明,NicC可以在NADH和氧气的参与下催化6HNA转化生成2,5-二羟基吡啶(2,5-DHP)和甲酸,还可以将对羟基苯甲酸转化生成对苯二酚。同位素标记实验表明,产物2,5-DHP中的氧原子来源于参与反应的氧气。为研究吡啶类化合物微生物代谢提供了理论基础。     

光催化材料-微生物杂合系统在化工领域的应用进展

随着化工行业的发展,化石能源短缺、环境污染严重等问题日益突出。如何开发新能源,实现化学品的绿色生物制造并修复化工污染,是发展绿色化工的核心问题。近年来,光催化材料-微生物杂合系统为解决上述问题带来新希望,该系统将光催化材料与微生物紧密耦合,充分发挥光催化材料能广谱高效捕获光能的特性以及微生物选择性酶催化功能,实现太阳能到化学能的高效转化。本文详细介绍了该系统的设计理念、作用机制及改进策略,并从生物能源、化学品制造和化工污染修复三个方面综述了该系统在化工领域的应用进展,指出了该领域现存的挑战与未来发展的趋势。