甜菜夜蛾群体繁殖及其对杀虫剂毒力敏感性测定

用黄豆粉、麦胚粉、酵母粉为主要营养成份研制成人工饲料,实现了甜菜夜蛾大量饲养及群体繁殖,与自然饲料相比,人工饲料饲养甜菜夜蛾幼虫存活与成虫产卵量明显增加,室内用浸渍法测定11种杀虫剂对甜菜夜蛾2龄幼虫的毒力,结果表明,田间甜菜夜蛾种群对除尽,米满,菜喜最敏感,其次是对抑太保,卡死克,毒丝本,高效灭百可,快灵,对锐劲特,氯氰菊酯,乙酰甲胺磷的毒力均已高度不敏感。     

斑马鱼ints12的CRISPR/Cas9敲除及其对UsnRNA剪接的调控

整合因子(Integrator)复合体通过调控UsnRNAs(U-rich small nuclear RNAs)的转录成熟过程, 影响pre-mRNA的内含子剪切, 对生物体内形成成熟mRNA有重要作用。但是在脊椎动物中, 整合因子复合体的表达调控及其发育功能研究尚十分缺乏。研究利用斑马鱼(Danio rerio)模型, 通过CRISPR/Cas9技术构建了ints12 (Integrator subunit 12)的基因敲除品系, 得到了2种缺失不同碱基的突变品系。在ints12的合子突变体(Zints12)中, 通过荧光定量PCR分析, 发现UsnRNA的3′box剪切存在缺陷。与同龄的野生型斑马鱼相比, Zints12体型偏小且表现为全雄。进一步研究发现, 在Zints12成体中, 细胞增殖相关因子出现显著下调表达, ints12自身pre-mRNA的加工也出现内含子滞留, 表明ints12对自身mRNA的剪切存在一个“自循环”式的调控模式。研究获得了斑马鱼的ints12基因敲除纯合突变体并发现ints12通过调控UsnRNA的剪切参与斑马鱼的个体生长和发育。     

UCA1及其剪接变异体与膀胱癌

尿路上皮癌胚抗原1 (urothelial carcinoma antigen 1,UCA1) 在人膀胱移行细胞癌细胞系 BLZ-211 中包含3个剪接变异体：UCA1、UCA1a 和 UCA1b. 我们以往的研究表明, UCA1、UCA1a 均属于长非编码 RNA (long non-coding RNA,lncRNA),它们之间具有一段长 1 265 bp 的共同序列. 组织表达谱分析表明,它们具有相似的组织表达模式,提示它们可能与胚胎发育和膀胱癌发生发展密切相关. 异位表达UCA1基因、UCA1a 基因均可以促进人膀胱癌细胞生长,增强细胞的恶性表型,使其体外增殖、迁移、侵袭、抗凋亡能力明显增加,裸鼠致瘤能力明显增强,表明它们在膀胱癌的发生发展中均起到了重要的促进作用. 本文将从基因结构、组织表达谱及机制功能等不同角度系统地阐述UCA1基因及其剪接变异体在膀胱癌中的研究现状与进展.     

骨骼肌细胞中UBXD8的敲除及其对脂质代谢的影响

UBXD8是能与p97/VCP相互作用共同参与内质网相关的泛素化后蛋白质降解过程的膜蛋白.新近的脂滴蛋白质组学研究表明UBXD8能够定位到脂滴上,同时有研究表明UBXD8调控甘油三酯的代谢.但是UBXD8调控甘油三酯代谢的分子机制并不清楚.因此我们采用改良的CRISPR/Cas9技术敲除小鼠成骨骼肌细胞C2C12中的UBXD8.从筛选出来的26个可能的UBXD8敲除单克隆细胞系中鉴定获得了2个确切的UBXD8敲除单克隆细胞系.研究表明,敲除UBXD8没有显著改变脂滴上蛋白质的分布,但敲除UBXD8增加了细胞内中性脂的累积.同时敲除UBXD8可缓解棕榈酸引起的胰岛素抵抗和抵抗棕榈酸引起的细胞凋亡.当在敲除UBXD8的细胞中重新过表达UBXD8后,细胞再次出现了棕榈酸引起的胰岛素抵抗及细胞凋亡.这些数据表明UBXD8在细胞脂质代谢及其异常所引起的胰岛素信号和细胞凋亡中起着十分重要的作用.     

甜菜夜蛾泰安郊区田间种群对杀虫剂的抗药性水平监测

测定了山东泰安市郊区甜菜夜蛾田间种群对11种杀虫剂的抗药性。用点滴法监测结果表明：该种群3龄幼虫对氯氟氰菊酯抗性最高(2445．5倍),其次为高效氯氰菊酯(586．5倍),均属极高水平抗性;对百树菊酯(123．8倍)属高水平抗性;对毒死蜱(39．1倍)、马拉硫磷(27．4倍)及灭多威(25．1倍)属中等水平抗性;对辛硫磷(8．1倍)抗性最低,属低水平抗性。用浸叶法监测结果表明：3龄幼虫对氯氟氰菊酯(856．5倍)和高效氯氰菊酯(250．7倍)也均属极高水平抗性;对百树菊酯(134．4倍)属高水平抗性;对毒死蜱(14．3倍)属中等水平抗性;对辛硫磷(8．1倍)属低水平抗性;对抑太保(4．2倍)、拉威因(4．2倍)、抑食肼(3．4倍)及虫酰肼(3．1倍)属敏感性降低阶段。两种监测方法的监测结果基本一致。     

RIG-I敲除293T细胞系的建立及其对B型流感病毒复制的影响

CRISPR/Cas9基因编辑技术是通过人工设计的单向导RNA(Single-guide RNA,sgRNA)指导Cas9蛋白对目的基因靶位点进行特异性的识别、结合和切割后,通过细胞的非同源末端连接或同源末端重组修复机制来完成对基因组的敲除与敲入的编辑技术。RIG-I是机体的一种模式识别受体,能够识别胞质中的含5′-三磷酸基团的RNA,并通过与下游信号分子MAVS相互作用,激活IRF3/7和NF-κB,从而启动I型干扰素和炎性因子的表达。已有研究表明,B型流感病毒(IBV)在感染早期能够上调RIG-I的表达水平。为了探索RIG-I是否为B型流感病毒激活抗病毒天然免疫信号通路的主要受体及其对IBV复制的影响,本研究利用CRISPR-Cas9技术对293T细胞中的RIG-I基因进行了敲除,经嘌呤霉素压力筛选到了一株稳定敲除RIG-I基因的293T(RIG-I-/-293T)细胞系。Western blotting检测发现,IBV或仙台病毒感染后该细胞系中RIG-I不再表达,说明该敲除细胞系构建成功。IBV感染RIG-I-/-293T细胞后,干扰素、炎性因子及干扰素刺激基因的转录水平与野生型...     

NPAS2基因敲除的HepG2细胞系构建及其对肝癌细胞凋亡的影响

目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建生物节律基因NPAS2敲除的HepG2肝癌细胞系,并初步探讨NPAS2基因敲除对肝癌细胞凋亡的影响。方法:利用sgRNA在线设计工具,针对NPAS2设计两条sgRNA;利用PX459质粒构建分别含有两条sgRNA的敲除载体PX459-sgRNA1;PX459-sgRNA2;利用T7核酸内切酶I检测两条sgRNA活性;将活性较高的打靶载体瞬时转染HepG2细胞,经过药物筛选,克隆化培养及基因测序后得到NPAS2敲除的HepG2肝癌细胞系;利用Western blot检测NPAS2蛋白的表达和凋亡相关蛋白Caspase3的活化;利用流式细胞仪检测敲除细胞系的凋亡水平。结果:成功构建了针对NPAS2的打靶载体;并筛选得到了活性较高的打靶载体;经过药物筛选和克隆化培养得到的NPAS2敲除肝癌细胞系未检测到NPAS2蛋白的表达;进一步发现NPAS2敲除的肝癌细胞Caspase3明显活化,凋亡水平显著升高。结论:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了NPAS2基因敲除的HepG2肝癌细胞系,并发现NPAS2敲除可以促进肝癌细胞凋亡,为进一步研究生物节律基因NPAS2及其它相关基因在肝癌发生发展中的作用机制提供了有力的工具。     

甜菜夜蛾不同龄期幼虫对药剂的敏感性及其与酶活力的关系

【目的】明确甜菜夜蛾Spodoptera exigua(Hübner)不同龄期幼虫对甲氨基阿维菌素苯甲酸盐和毒死蜱的敏感性及其与羧酸酯酶、多功能氧化酶、谷胱甘肽S-转移酶和乙酰胆碱酯酶活性的相关性。【方法】采用室内生物测定方法检测甜菜夜蛾不同龄期幼虫对药剂的敏感性,并检测了不同龄期幼虫体内羧酸酯酶、多功能氧化酶、谷胱甘肽S-转移酶和乙酰胆碱酯酶的活力。【结果】在所测定的5个龄期中,随龄期增加,敏感性逐渐降低,其中1~5龄幼虫对甲氨基阿维菌素苯甲酸盐的LC50分别为0.1010、0.3561、0.7568、1.4325和8.4390 mg/L,对毒死蜱的LC50分别为27.4632、46.8495、87.5222、129.3217和1 356.6770 mg/L。单头幼虫的羧酸酯酶、多功能氧化酶、谷胱甘肽S-转移酶和乙酰胆碱酯酶活力随虫龄的增加而提高,与龄期间对药剂的敏感性呈负相关(由于外源化合物摄入量减少,5龄单头幼虫的多功能氧化酶活力略有降低)。【结论】甜菜夜蛾不同龄期幼虫对药剂的敏感性存在非常明显的差异,在田间防治中,应选择对杀虫剂敏感性较高的低龄幼虫作为最佳防治时期。     

敲除LTA4H基因的PK-15细胞系构建及其对口蹄疫病毒复制的影响

【目的】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建白三烯A4水解酶(leukotriene A4 hydrolase, LTA4H)基因缺失的猪肾细胞系(porcine kidney-15, PK-15),探究LTA4H对口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)复制的影响,为开展LTA4H功能研究及调控病毒复制机制研究提供理论依据。【方法】设计2条针对猪LTA4H基因的引导RNA (small guide RNA, sgRNA),分别构建至载体pX459-puro-MCS中;将CRISPR重组质粒转染PK-15细胞,用嘌呤霉素(puromycin)抗生素筛选,并通过有限稀释法筛选单克隆细胞,之后通过Western blotting和测序检测LTA4H基因的敲除,获得LTA4H基因功能缺失细胞系。使用Western blotting、RT-qPCR及病毒滴度测定等方法检测敲除LTA4H基因后对FMDV复制及相关蛋白的表达情况。【结果】获得的单克隆敲除细胞系与野生型细胞相比,能够显著抑制FMDV复制。【结论】本研究成功构建了LTA4H基因敲除的PK-15细胞系,证明LTA4H对FMDV的复制具有促进作用,研究结果为后续LTA4H功能研究提供理论依据。     

温度对甜菜夜蛾飞行能力的影响

温度对甜菜夜蛾飞行能力有显著的影响（P<0.05）。在16～32℃内,成虫均能进行正常的飞行活动。24℃下的成虫飞行能力最强,在15 h的吊飞飞行中,成虫飞行距离最远（37.14 km）、飞行速度最快（0.87 m/s）、飞行时间最长（11.73 h）。温度低于２０℃或高于２８℃时,其飞行能力均显著降低。甜菜夜蛾在不同温度下飞行时对主要能源物质（甘油三酯）的利用效率不同。在较适宜的温度下,尽管成虫飞行消耗的甘油三酯较多,但单位飞行距离所消耗的甘油三酯却较少,即利用效率较高,表明成虫飞行能源物质利用效率的不同是导致其在不同温度下飞行能力产生差异的主要原因之一。     

Reproduction-flight relationship in the beet armyworm, Spodoptera exigua (Lepidoptera: Noctuidae)

To evaluate the relationship between reproduction and migratory flight, we examined ovaries, tethered flight, and egg laying in the beet armyworm, Spodoptera exigua (Hübner). Ovarian development in female S. exigua was classified into five stages in relation to the postemergence age of the moths. Oviposition peaked at ovarian stages III and IV. Mating accelerated ovarian development in this species, and thus the mated females developed faster than the virgin moths in ovaries. In virgin adults, flight capacity increased from the first day to the third day after emergence and remained at a high level until the moths were 7 d old. In contrast, the mated moths reached the maximum flight capacity in 2 d after emergence and maintained a high level until the age of 7 d. However, mating status could not influence the flight capacity of the beet armyworm, although there were general differences in flight capacity between virgin and mated adults at the same age. Moreover, significant correlations between the number of eggs laid and the flight capacity were not performed by the mated moths. These results showed that mating status and ovarian development did not seem to influence flight capacity in the beet armyworm, which was not in agreement with the definitions of the oogenesis-flight syndrome observed in many other migratory insects.     

甜菜夜蛾交配行为和能力

在(27±1)℃,光周期L14∶D10的条件下对甜菜夜蛾I>Spodoptera exigua的交配行为及能力进行了研究。结果表明：成虫在羽化当晚即可进行交配,交配率以羽化后头三个晚上的较高(>82%),但从第4天起则显著下降。成虫一天中的交配时间出现于23:30～05:30之间,交配高峰出现在01:30～02:30和03:00～04:00 之间, 其中以第1高峰的发生频率较高。成虫交配持续时间从22～191 min不等,但以30～60 min的为多(40.8%, n=97), 60～90 min的次之(19.4%),超过180 min的较少(10.2 %)。另外,交配持续时间与蛾龄紧密相关。蛾龄越大,交配持续的时间越长,且差异显著。雄蛾一生的交配能力由1～11次不等,但受性比的影响显著：在性比为1∶1的条件下,雄蛾平均交配次数仅为3.0 次,而在2♀∶1♂至5♀∶1♂时,则增加到5.1～6.0 次。雌蛾交配比例及次数受性比的影响也很大：没有交配的雌蛾比例从1∶1时的8.3%增加到5♀∶1♂时的32%,仅交配一次的比例从16.7%增加到38.7%,而交配≥5 次的比例则从 25%下降到0。最后,对这些结果在甜菜夜蛾防治中应用的可能性进行了讨论。     

An insensitive acetylcholinesterase confers resistance to methomyl in the beet armyworm Spodoptera exigua (Lepidoptera: Noctuidae)

Two forms of acetylcholinesterase were identified in field populations of the beet armyworm, Spodoptera exigua (Hübner), collected from cotton in San Joaquin Valley, CA. Strains (BESS and BKRR) homogeneous for each variant were isolated and their relative susceptibilities to methomyl, chlorpyrifos, and chlorpyrifos-oxon assessed by topical application bioassay. In comparisons with a laboratory susceptible strain (DOW), BKRR and BESS expressed 68-fold and sevenfold resistance, respectively, to the carbamate methomyl. Neither strain was cross-resistant to chlorpyrifos or its oxygen analog (chlorpyrifos-oxon). In biochemical studies, the BKRR AChE enzyme was approximately 30-fold and sixfold more insensitive to methomyl and chlorpyrifos-oxon, respectively, compared with the DOW enzyme. The correlation between the toxicological and biochemical studies provides strong evidence that target-site insensitivity is an important mechanism of resistance to methomyl. The lack of significant cross-resistance to chlorpyrifos suggests that the insensitive AChE in these field populations was selected by methomyl alone and not by the organophosphate.     

Genetic effects on flight capacity in the beet armyworm,Spodoptera exigua (Lep., Noctuidae)

The beet armyworm, Spodoptera exigua, is an important migratory insect pest in tropical and subtropical regions worldwide. The current study investigated genetic variation in the flight capacity of both female and male moths, using a quantitative genetics approach. The offspring–parent regression showed that parents had a significant influence on the flight duration of offspring, and the heritability estimated as 0.302. The upward selection increased mean flight duration from 123.7 to 284.6 min in females and from 113.9 to 254.0 min in males during 8 h of flight test; by contrast, downward selection decreased it from 123.7 to 65.6 min in females and from 113.9 to 29.8 min in males, while it did not change significantly in either females or males of the control line over eight generations. The mean realized heritability was estimated as 0.432 based on upward selection but 0.130 on downward selection, suggesting the asymmetry of response to selection on flight capacity. Reciprocal crosses between the two selected lines confirmed the dominance of ‘long‐flying genes’ in the inheritance of flight capacity. A positive genetic correlation was found between increased flight duration and pupal weight. The presence of such additive genetic variance and covariance for flight capacity and the fitness trait, pupal weight, in the population of S. exigua may have underpinned the evolution of its migratory behaviour.     

幼虫密度对甜菜夜蛾生长发育与繁殖的影响

为了研究甜菜夜蛾Spodoptera exigua(Hübner)幼虫的密度对其发育及繁殖的影响,本实验观察了5种幼虫密度下（1,5,10,20,30头/瓶）,幼虫发育和成虫繁殖情况。结果表明：幼虫和蛹历期、存活率和蛹重均差异显著。幼虫和蛹历期均以20头/瓶的最短,1头/瓶的最长,其余随幼虫密度增加而延长;幼虫至蛹存活率以10头/瓶的最高,其余随幼虫密度增加而降低;1头/瓶的蛹最重,显著高于其他密度的,其余随幼虫密度增加而下降。尽管密度间成虫羽化率和产卵前期均无显著差异,但成虫产卵量、寿命和畸形率差异显著。1头/瓶的产卵量最多,其次为10头/瓶的,其余随幼虫密度增加而减少,30头/瓶的产卵量显著少于其他密度的; 密度在1～20头/瓶范围内,雌蛾寿命均较短,显著短于30头/瓶的,而雄蛾寿命以5头/瓶的最短,显著短于其他密度的（10头/瓶除外）,10头/瓶的次之,其余密度间差异不显著;不同幼虫密度下羽化的成虫畸形率差异显著,10头/瓶的最低,其余随幼虫密度增加而升高; 生命表结果表明甜菜夜蛾在10头/瓶下世代存活率和种群增长指数均最高,幼虫密度过低或过高均不利于种群增长;世代存活率（S）和种群增长指数（I）与幼虫密度之间的关系均呈抛物线关系：S =－0.2087x²+2.5694x+211.52 (R²=0.88),I=－0.0552x²+0.9166x+54.168 (R²=0.95)。结果提示幼虫密度影响甜菜夜蛾种群动态的重要生态因子之一。     

甜菜夜蛾谷氧还蛋白SeGrx原核表达、纯化及酶学性质分析

【目的】谷氧还蛋白(glutaredoxin, Grx)是生物体内依赖硫醇的抗氧化酶,在生物氧化胁迫和细胞凋亡等许多重要的生命活动中发挥作用。本研究旨在测定甜菜夜蛾Spodoptera exigua谷氧还蛋白家族成员SeGrx1的基因序列以及酶催化反应特性,为揭示其在昆虫体内功能奠定基础。【方法】以前期获得的甜菜夜蛾转录组数据为基础,采用RACE-PCR技术克隆甜菜夜蛾Grx1基因cDNA全长序列。将甜菜夜蛾Grx1基因的ORF序列连接至pET-16b原核表达载体,转化至大肠杆菌Escherichia coli BL21菌株中,IPTG诱导融合蛋白表达后用镍柱和Superdex75/200分子筛纯化;采用荧光酶标仪测定纯化的SeGrx1的活性及酶促反应动力学参数。【结果】甜菜夜蛾SeGrx1基因(GenBank登录号: MK318813) cDNA全长738 bp,其中5′非编码区长40 bp,3′非编码区长347 bp,开放阅读框(ORF)全长351 bp,编码116个氨基酸,预测蛋白的相对分子量为12.57 kD,活性位点为CPYC,为双巯基谷氧还蛋白。SeGrx1中心由4个平行和反向平行的β-strand混合组成,外围被5个α螺旋包围。成功构建pET-16b-SeGrx1重组质粒并在大肠杆菌中高表达,经过诱导和纯化条件的优化,获得纯度在95%以上的SeGrx1目的蛋白。以人类谷氧还蛋白hGrx1为标准,SeGrx1比活力为0.577 U/mg pro,最大反应速度V_max为20.5 U/mg pro,米氏常数Km为14.3 nmol/L。【结论】本研究成功地在体外大量表达了甜菜夜蛾谷氧还蛋白SeGrx1,并且获得了它的酶促动力学参数,为进一步挖掘谷氧还蛋白的生物学功能,探索其在害虫防治中的应用提供了基础。     

甜菜夜蛾抗药性研究现状

就有关甜菜夜蛾Spodoptera exigua(Hbner)对常用杀虫剂的抗药性现状作综述。甜菜夜蛾对拟除虫菊酯类、有机磷类、氨基甲酸酯类杀虫剂已产生了较高水平的抗药性,其中山东泰安抗性种群对氯氟氰菊酯的抗性高达2445.5倍;对多杀菌素等生物杀虫剂产生了中低水平的抗性;对昆虫生长调节剂如虫酰肼的敏感性也有所降低,但昆虫生长调节剂依然是比较理想的防治药剂。对交互抗性及抗性治理也作了阐述。     

甜菜夜蛾过氧化氢酶cDNA序列克隆、 序列分析和表达特征

过氧化氢酶 (catalase, CAT)作为生物体内的重要物质, 其主要功能是参与活性氧代谢过程, 在清除H₂O₂、 超氧自由基和过氧化物以及阻止羟基自由基形成等方面发挥着重要作用。本研究利用RT-PCR技术和RACE方法首次克隆和分析了甜菜夜蛾Spodoptera exigua （Hübner）CAT基因, 命名为SexiCAT, GenBank登录号为JN051294, 其cNDA序列全长为1 755 bp, 开放阅读框长1 524 bp, 推测编码507个氨基酸。经氨基酸序列比对, 此多肽序列具有高度保守性, 与其他昆虫CAT的序列一致性分别为： 家蚕Bombyx mori （87%）、 黑腹果蝇Drosophila melanogaster （73%）、 埃及伊蚊Aedes aegypti （71%）和赤拟谷盗Tribolium castaneum （70%）。对该基因在甜菜夜蛾各个发育时期以及不同组织表达量的荧光定量PCR分析表明, SexiCAT基因在甜菜夜蛾各个发育阶段的表达水平存在显著差异, 其中成虫期的表达量最高, 是卵期表达量的7倍, 幼虫期次之, 卵期最低; SexiCAT基因在5龄幼虫体壁、 中肠、 脂肪体和马氏管组织中都有表达, 但在脂肪体中表达量最高。甜菜夜蛾SexiCAT基因的成功克隆及同源建模将为今后对其功能研究以及作为靶标设计新型氧化酶抑制剂提供了基础。     

不同地区甜菜夜蛾种群的遗传多样性分析

甜菜夜蛾Spodoptera exigua (Hübner)是一种重要的农业害虫,曾给我国农牧业生产造成过重大的经济损失。为了阐明甜菜夜蛾的种群动态规律,改善和提高其预测、防治水平,我们应用扩增片段长度多态性(AFLP)技术对我国7个甜菜夜蛾种群的42头雄蛾的遗传多样性进行了研究分析。结果表明,不同种群个体间遗传相似性指数分布在0.143～0.824之间,同一种群内不同个体间的遗传相似性指数分布在0.250～0.786之间,同一种群内个体间的遗传相似性指数有许多小于不同种群个体间的。江西种群的多态性条带比例最低,为80.7%; 山东种群的多态性条带比例最高,达88.6%。总体而言,北方种群内的遗传多样性高于南方种群。聚类分析结果表明,同一种群的个体并不总能聚在一起,即种群间不存在明显的遗传分化。这些结果为明确我国甜菜夜蛾的迁飞规律及各发生危害区的虫源关系提供了进一步的实验依据。