我国流行性乙型脑炎病毒毒力和抗原性的研究

流行性乙型脑炎(乙脑)病毒的毒力,多与毒株的大小空斑数的比例有关;同株内大斑小斑的特征各异。60年代和80年代的乙脑毒株,其毒力无明显差异。单克隆抗体(McAb)51～8对15株乙脑病毒的中和指数(log10)为:6.05～6.25者3株,5.08～5.67者5株,4.0～4.67者4株,1.95～3.83者3株。这种差别与毒株的分离年份和地区无关。多克隆抗体(PcAb)的中和指数(log10):5.0～5.33者11株,4.0～4.73者4株。可见McAb能较好地反映乙脑毒株的抗原性差别。文中讨论了毒力检查和McAb抗原分析的流行病学和免疫学意义。     

乙型脑炎单克隆抗体羊血球结合物的被动凝集和被动凝集抑制试验在乙型脑炎诊断中的应用

实验比较了所获得的5株乙脑单克隆抗体(McAb)与经戊二醛和甲醛处理的羊血球的结合能力,证实5株中以I_4McAb(IgM亚类)较好。 以乙脑单克隆抗体羊血球结合物(简称McAb-血球)的被动凝集试验(RPHA),检测乙脑病毒的不同毒株及同类的其它病毒,结果McAb-血球能和A2、SA14、高顺生、P3和中山株发生良好的凝集反     

用乙脑病毒减毒株单克隆抗体分析乙脑病毒强毒株和减毒株的抗原差别

用乙型脑炎(乙脑)病毒强毒株免疫制备的单克隆抗体(McAb)分析证明强毒株之间的抗原差别,已有研究报道。本实验用乙脑病毒减毒活疫苗2-8株免疫制备的McAb分析强毒株和减毒株之间的抗原差别。 一、乙脑病毒株 2-8株和5-3株均为减毒活疫苗株。SA14株和A2株均为强毒株,SA14株是2-8株和5-3株的母株,A2株是国内实验室标准株。     

用流行性出血热单克隆抗体对我国不同地区出血热病毒株的抗原分析

从全国17个省市自治区收集了自病人及各种动物分离到的40株流行性出血热病毒(EHFV),用出血热病毒单克隆抗体(McAb)进行抗原分析,发现大多数省市分离的EHFV株能与MA25-1 McAb起反应,但湖北、湖南分离的EHFV不与之起反应,而该McAb对EHFVA9株抗原的滴度为1/2560。实验还发现,湖北省内长江以北地区分离的EHFV毒株Q25、J173。WP43和从江南地区分离的EHFV毒株A24和HA1018在抗原性上也有明显不同。     

乙型脑炎病毒单克隆杂交瘤抗体细胞系的建立及其应用于抗原性比较

本文建立了13侏乙脑单克隆抗体杂交瘤细胞系,对其中6株进行了特性研究,结果表明该6株中3株为乙脑病毒种特异性抗体,3株为乙脑病毒亚组特异性抗体。以免疫荧光技术对12株国内外分离的乙脑病毒进行了抗原性比较,结果表明我国分离的大多数病毒株间无明显的抗原性差异,但个别近年来分离的病毒侏如云南的Y-M60,福建的NY,湖南的X8103株与1949年北京分离的P_3株即目前用于灭活疫苗生产的病毒株间有一定的差异。我国的大多数病毒株与日本的中山(NaK)株则有明显的差别。此外,并发现2株单克隆抗体对我国的全部野病毒株有高滴度的强荧光反应而对14-2减毒株仅有十分微弱反应,甚至无反应。以上结果提示乙脑不同病毒株间存在抗原性差异,但是否有免疫保护上的抗原性差异尚待进一步研究。     

表达乙型脑炎病毒抗原的非复制型重组痘苗病毒能在小鼠中诱发免疫保护

使用2×107PFU乙脑病毒野毒株GSS抗原preM-E-NS1-NS2a的非复制型重组痘苗病毒NTV-JEV免疫3周龄BALB/c小鼠,小鼠体内乙脑病毒特异性抗体滴度1∶71,IgG2a/IgG1为1.5,中和抗体滴度为1∶8,免疫组小鼠产生特异性补体介导的细胞杀伤作用。以10 LD50乙脑P3株病毒对小鼠进行了脑内攻击,NTV-JEV免疫组小鼠存活率为100%,与乙脑减毒活疫苗SA14-14-2免疫组存活率相同。100 LD50P3株病毒攻击后NTV-JEV免疫组存活率28.6%,与SA14-14-2组免疫效果无明显差别。存活小鼠体内乙脑病毒特异性抗体升高为1∶179,IgG2a/IgG1比值为1.9,中和抗体大于1∶16。以30 LD50GSS株病毒进行攻击后,NTV-JEV免疫组和SA14-14-2组保护率均为8.3%。上述结果表明,NTV-JEV与乙脑减毒活疫苗SA14-14-2株具有相近的保护力,NTV-JEV不仅可以保护小鼠抵抗同株病毒GSS的攻击,而且可以抵抗异株病毒P3的攻击。     

应用抗体捕捉ELISA法测定病毒特异性IgM抗体

本文以测定麻疹IgM抗体为模型,研究了应用抗体捕捉酶联免疫吸附法(Antibody capture ELISA简称ACELISA)测定病毒性疾病特异性IgM抗体的实验条件,结果表明;用于包被的抗μ链抗体、抗原,检测抗体的剂量对所测得的标本OD值都有不同程度的影响,其中以抗原的影响最大,不同株单克隆抗体(McAb)作检测抗体效果也有差别,最佳株与多克隆抗体(PcAb)相似,以本方法测定麻疹IgM抗体的敏感性和特异性很高,并不受类风湿因子的干扰。     

广东省10株乙型脑炎病毒的分子特征研究

了解广东省目前流行的乙型脑炎病毒的基因型别,以及新分离毒株与P3和SA14-14-2疫苗株E蛋白的氨基酸差异,推测疫苗株的可能保护效果。本研究对广东省2017年从蚊虫和蠓虫标本分离的10株乙型脑炎病毒基因组序列测定,利用MEGA软件登录GenBank下载乙型脑炎病毒代表株序列并绘制进化树,同时用ClustalW2软件与疫苗株进行氨基酸同源性比对和E蛋白的序列分析。10株乙型脑炎病毒均属基因I型GI-b组,但分别位于2个不同的、小的进化分枝中。10株新分离病毒与P3和SA14-14-2疫苗株的E蛋白氨基酸同源性分别位于97.40%~97.60%和97.20%~97.40%之间。E基因区段500个氨基酸中,P3株与新分离乙型脑炎病毒株之间共存在17个氨基酸位点的差异(包括12个共同氨基酸的改变),略高于SA14-14-2疫苗株的16个氨基酸位点变异(包括11个共同氨基酸的改变)。其中在DI区的P3和SA14-14-2株分别有1个和3个共同氨基酸变异,DⅡ区各有5个共同氨基酸改变,DⅢ区分别有5个和2个共同氨基酸改变,结构域之外各有1个共同氨基酸的变异。绝大多数变异发生在非关键位点,只在E306和E388处观察到的氨基酸位点变异与疫苗P3株关键位点的改变有关,这两个位点(G306E,E388G)均发生在DⅢ区,而疫苗SA14-14-2未观察到关键位点的改变。总之,广东省流行的乙型脑炎病毒基因型别可能已由Ⅲ型变为I型;疫苗SA14-14-2株及P3株与新分离毒株均具有很高的同源性,绝大多数关键氨基酸位点未发生变异,对新分离病毒均具有良好的免疫保护价值。     

浙江省麻疹病毒分离株的基因特性与免疫原性研究

为了研究浙江省1999～2003年麻疹病毒分离株的抗原性变化以及基因特性,阐明其基因特性与麻疹流行的关系,以及抗原性变化对疫苗免疫效果的影响。我们从麻疹患者含漱液中分离麻疹病毒株,制备大鼠免疫血清,与疫苗株沪191和Edmonston株等进行交叉中和试验,测定各毒株之间抗原比;并采集儿童麻疹疫苗免疫前后血清,分别测定其对不同毒株的中和抗体滴度;采用RT-PCR法扩增麻疹毒株血凝素蛋白(H)及核蛋白(N)基因,进行核苷酸序列测定。结果浙江99-1和浙江02-2株与沪191株之间的抗原比分别为3.0和7.3;儿童免疫后血清对浙江02-2株的麻疹中和抗体平均几何滴度(GMT)为15.03,明显低于沪191疫苗株(GMT为68.12);浙江省1999～2003年麻疹分离株之间,H基因氨基酸同源性为99.8%,N基因氨基酸同源性为98.5%～100.0%;与沪191疫苗株的H基因和N基因相比较,分离株与其在氨基酸水平上同源性分别为95.5%～95.7%和95.9%～96.3%。从基因进化树显示,1999～2003年浙江省分离到的麻疹毒株属于H1基因型,但与疫苗株沪191在抗原性和基因特性上已存在明显的差异。     

浙江省麻疹病毒分离株的基因特性与免疫原性研究

为了研究浙江省1999～2003年麻疹病毒分离株的抗原性变化以及基因特性,阐明其基因特性与麻疹流行的关系,以及抗原性变化对疫苗免疫效果的影响.我们从麻疹患者含漱液中分离麻疹病毒株,制备大鼠免疫血清,与疫苗株沪191和Edmonston株等进行交叉中和试验,测定各毒株之间抗原比;并采集儿童麻疹疫苗免疫前后血清,分别测定其对不同毒株的中和抗体滴度;采用RT-PCR法扩增麻疹毒株血凝素蛋白(H)及核蛋白(N)基因,进行核苷酸序列测定.结果浙江99-1和浙江02-2株与沪191株之间的抗原比分别为3.0和7.3;儿童免疫后血清对浙江02-2株的麻疹中和抗体平均几何滴度(GMT)为15.03,明显低于沪191疫苗株(GMT为68.12);浙江省1999～2003年麻疹分离株之间,H基因氨基酸同源性为99.8%,N基因氨基酸同源性为98.5%～100.0%;与沪191疫苗株的H基因和N基因相比较,分离株与其在氨基酸水平上同源性分别为95.5%～95.7%和95.9%～96.3%.从基因进化树显示,1999～2003年浙江省分离到的麻疹毒株属于H1基因型,但与疫苗株沪191在抗原性和基因特性上已存在明显的差异.     

Molecular basis for attenuation of neurovirulence of a yellow fever Virus/Japanese encephalitis virus chimera vaccine (ChimeriVax-JE)

A yellow fever virus (YFV)/Japanese encephalitis virus (JEV) chimera in which the structural proteins prM and E of YFV 17D are replaced with those of the JEV SA14-14-2 vaccine strain is under evaluation as a candidate vaccine against Japanese encephalitis. The chimera (YFV/JEV SA14-14-2, or ChimeriVax-JE) is less neurovirulent than is YFV 17D vaccine in mouse and nonhuman primate models (F. Guirakhoo et al., Virology 257:363-372, 1999; T. P. Monath et al., Vaccine 17:1869-1882, 1999). Attenuation depends on the presence of the JEV SA14-14-2 E protein, as shown by the high neurovirulence of an analogous YFV/JEV Nakayama chimera derived from the wild JEV Nakayama strain (T. J. Chambers, A. Nestorowicz, P. W. Mason, and C. M. Rice, J. Virol. 73:3095-3101, 1999). Ten amino acid differences exist between the E proteins of ChimeriVax-JE and the YFV/JEV Nakayama virus, four of which are predicted to be neurovirulence determinants based on various sequence comparisons. To identify residues that are involved in attenuation, a series of intratypic YFV/JEV chimeras containing either single or multiple amino acid substitutions were engineered and tested for mouse neurovirulence. Reversions in at least three distinct clusters were required to restore the neurovirulence typical of the YFV/JEV Nakayama virus. Different combinations of cluster-specific reversions could confer neurovirulence; however, residue 138 of the E protein (E(138)) exhibited a dominant effect. No single amino acid reversion produced a phenotype significantly different from that of the ChimeriVax-JE parent. Together with the known genetic stability of the virus during prolonged cell culture and mouse brain passage, these findings support the candidacy of this experimental vaccine as a novel live-attenuated viral vaccine against Japanese encephalitis.     

Construction of human Fab (gamma1/kappa) library and identification of human monoclonal Fab possessing neutralizing potency against Japanese encephalitis virus

A combinatorial human Fab library was constructed using RNAs from peripheral blood lymphocytes obtained from Japanese encephalitis virus hyper-immune volunteers on pComb3H phagemid vector. The size of the constructed Fab library was 3.3x10(8) Escherichia coli transformants. The library was panned 3 times on the purified Japanese encephalitis virus (JEV) virion, and phage clones displaying JEV antigen-specific Fab were enriched. The enriched phage pool was then screened for clones producing Fab molecule with JEV neutralizing activity by the focus reduction-neutralizing test. Among 188 randomly selected clones, 9 Fab preparations revealed neutralizing activities against JEV strain Nakayama. An E. coli transformed with TJE12B02 clone, which produced human monoclonal Fab with the highest neutralizing activity was cultured in a large scale, and the Fab molecule was purified using affinity chromatography. The purified FabTJE12B02 showed the 50% focus reduction endpoint at the concentration of 50.2 microg/ml (ca. 1,000 nM) when JEV strain Nakayama was used. The FabTJE12B02 recognized E protein of JEV strain Nakayama, and the dissociation equilibrium constant (Kd) of the FabTJE12B02 against purified JEV antigen was calculated as 1.21x10(-8) M. Sequence analysis demonstrated that TJE12B02 used a VH sequence homologous to the VH3 family showing 88.8% homology to germline VH3-23, and used a Vkappa sequence homologous to the VkappaII subgroup showing 92.8% homology to germline A17.     

不同代次毒种乙脑减毒活疫苗的滴度和安全性实验结果比较

为比较不同代次的乙脑毒种在疫苗制备过程中对疫苗质量的影响,特制备不同代次的工作种子SA14 14 2PHK7、PHK8、PHK9,检定合格后,分别用这几批毒种制备乙脑减毒活疫苗,检定和比较疫苗的滴度和各项安全性指标。实验表明SA14 -14 -2PHK7、PHK8和PHK9三个代次的乙脑毒种制备的乙脑疫苗平均滴度为 6. 43lgPFU/ml;乳鼠传代返祖试验均值为 1. 1lgLD50 /0. 03ml;致病力均为阴性。证实乙脑毒种SA14 -14 -2 10代以内的生物学特性是稳定的,对疫苗的影响无显著差异。10代以内的乙脑毒种可安全的用于疫苗生产。     

马立克氏病毒单克隆抗体的研究

获得了4株分泌马立克氏病毒(MDV)特异性单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞:4BS10对MDV所有毒株呈阳性反应;4CN8 对MDV血清1,3型毒株发生反应;2BN90和4CN24只对MDV血清1型毒株有阳性反应。3个McAb属IgG1,1个为IgG2b,均不中和MDV,免疫扩散试验也无沉淀线。对禽白血病毒(ALV)无交叉反应。 以2BN90和辣根过氧化物酶、异硫氰酸荧光素的结合物进行直接酶联免疫吸附试验和直接荧光抗体试验,均获得成功。抗体滴度前者为1/51,200,后者为1/640。对ALV无交叉反应。     

一株抗H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体的广谱中和活性

以H5N1禽流感病毒株Ck/HK/Yu22/02作为抗原,应用常规杂交瘤技术和血凝抑制实验筛选出抗H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的单抗8H5,单抗8H5经免疫荧光鉴定具有很好的H5特异性.选择33株2002～2006年不同地域,不同宿主中分离的不同遗传变异亚系的H5N1病毒代表株,对单抗8H5分别进行血凝抑制实验及中和试验分析,结果显示单抗8H5对所有H5亚型病毒均有较强反应,而对非H5亚型标准病毒株均不反应,说明8H5是一株广谱性抗H5特异性中和单抗,并提示单抗8H5的HA识别表位可能是一个相当保守的中和表位.并且单抗8H5双抗夹心系统的初步评价显示了其在诊断应用上的前景.     

我国2009年新分离乙脑病毒全基因组序列特征研究

本研究对我国2009年新分离的两株乙脑病毒进行全基因组序列测定和分析,以了解病毒全基因组分子特征。通过RT-PCR和核苷酸序列测定方法获得病毒全基因组序列,采用ClustalX、DNASTAR、MEGA等生物学软件完成核苷酸序列及氨基酸序列分析和系统进化分析等。研究结果显示,新分离两株乙脑病毒YN0911和YN0967株基因组全长均为10 965个核苷酸,编码3 432个氨基酸。这2株乙脑病毒之间核苷酸同源性为98.7%,氨基酸同源性为99.8%。与国际乙脑病毒流行株相比,核苷酸同源性为83.5%～98.9%,氨基酸同源性为94.8%～99.7%。与乙脑病毒疫苗株SA14-14-2相比,在E蛋白有13个氨基酸差异位点,但都位于抗原关键位点之外。这2株病毒在3′UTR区域存在11nt缺失。基于C/PrM区段、E基因、全基因组系统进化分析结果均显示新分离2株乙脑病毒为G I乙脑病毒,并且和越南、四川、贵州、广西以往的分离株遗传进化关系较近。本研究提示我国新分离的2株乙脑病毒均为G I乙脑病毒,决定病毒毒力的关键氨基酸位点未见明显变化。     

单克隆抗体对感染流行性感冒病毒的小鼠的疗效观察

治疗流行性感冒(简称流感)对年老体弱者有着重要意义。由于流感病毒的一个新亚型出现后,往往要经历十几年至20多年的流行,因此选出具有亚型内共同抗原决定簇的McAb,用于治疗流感是可行的,文献也曾有过报道。前文已报道关于甲3型流感病毒McAb的建立,本文用抗甲3型流感病毒上海/32/84血凝素McAb,与1977年以来分离的甲3型流感     

用免疫荧光单克隆抗体对脊髓灰质炎病毒抗原表位的分析

用间接免疫荧光与中和试验筛选出来的抗脊髓灰质炎2型与3型不同毒株的12个单克隆抗体,其中3个仅有免疫荧光活性,9个具有中和与免疫荧光活性。用免疫荧光活性的单克隆抗体进行试验,发现它们在识别特异性抗原表位方面与中和性单克隆抗体相似,显示出株特异的、几个毒株共同特异的或型特异的抗原表位。根据表位分布关系及特征,可以用来鉴别型内毒株的特征、毒株的抗原分析、抗原变异的研究以及疫苗相关病例的鉴别。所得结果与中和性单克抗隆抗体及T1-寡核苷酸指纹图谱分析一致。而免疫荧光单克隆抗体识别抗原表位的活性范围比中和性单克隆抗体更广。另外还发现某些兼有荧光与中和两活性的同一个单克隆抗体,用不同方法(IF与NT)进行试验时,与相同毒株出现不同表位反应,这点是值得引起注意需待进一步证实的重要问题。