逆病毒载体对准脑瘤

号外消息!用重组病毒去摧毀肿瘤的人体实验指日可待拦窬膊〖爸蟹缪芯克?NINDS)已经获得重组DNA顾问委员会(RAC)的允许,准备将经过基因工程改造的、能产生逆病毒载体(内含疱疹病毒酶胸苷激酶)的小鼠成纤维母细胞注射到晚期脑癌患者的肿瘤群中。专家准备挑选出20名患有原位脑肿瘤或者转移到脑内的肿瘤的病人来试验。这些人经过常規治疗无效。应用趋实造影技术,如MRI,可对肿瘤进行定位,再将上述细胞注射到正确的位点上。这些成纤维细胞携带着小鼠白血病逆病毒,它们能将疱疹病毒的胸苷激酶传送给肿瘤细胞。这种酶是抗癌药物ganci-     

高温α-淀粉酶基因突变体在大肠杆菌、毕赤酵母中的表达

对地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)高温α-淀粉酶(amyE)基因进行改造获得的基因突变体(amyEM),通过PCR扩增,将此基因分别克隆至大肠杆菌表达载体pBV220和毕赤酵母表达载体pPIC9K上,并分别转化大肠杆菌DH5α和毕赤酵母GS115感受态细胞,获得重组大肠杆菌和重组毕赤酵母。通过表达产物的酶活性检测和SDS-PAGE分析,证明突变α-淀粉酶(AmyEM)在大肠杆菌、毕赤酵母中获得有效表达。对重组大肠杆菌产生的α-淀粉酶的粗酶性质分析表明,此酶分子量约为55kDa。其最适反应温度为80℃~90℃,与野生型基因相比,其最适pH均为6.0,但不同的是突变体在pH 5.0~5.5时表现出较高的酶活力;在毕赤酵母细胞的表达产物可分泌至胞外。由于酵母可对蛋白进行糖基化,酶分子量增加到60kDa,最适pH也改变为5.5。此高温α-淀粉酶突变体所具有的在微酸性环境具有较高酶活力的性质,具有重要的潜在工业应用价值。     

逆转录病毒载体用于基因治疗的安全性

自1989年5月22日首项获得批准的临床基因标记试验开始实施以来,截止1993年5月,已登记的有关基因标记和墓因治疗计划近50个,已开始执行的26个,共有113位患者接受了基因标记或基因治疗。在这些方案中,绝大多数是以逆转录病毒作为载体将目的基因导入人体细胞的。与其它基因导入方法(如理化法、膜融合法等)相比,逆转录病毒法有独特的优点:1)转染效率高,可达100％;2)进入每个靶细胞的外源基因可控制至一个拷贝;3)能稳定有效地整合到宿主细胞基因组,保证在感染细胞     

植物转化中的安全标记基因

转基因植物中的除草剂或抗生素抗性标记基因的生态环境和食用安全性一直颇有争议.糖类分解代谢酶基因作为安全标记基因,近年来在植物转化中显示了巨大应用潜力.这类标记基因编码产物是筛选剂糖类的分解代谢酶,使转化细胞能利用筛选剂糖类作为主要碳源从而获得优势生长,非转化细胞则因饥饿生长被抑制但不被杀死,故称为正筛选系统(positive selection system).目前木糖异构酶基因（xylose isomerase,xylA）和磷酸甘露糖异构酶基因（phosphomannose isomerase,pmi)等安全标记基因已成功应用于植物转化.     

代谢工程改造酿酒酵母生产β-胡萝卜素

β-胡萝卜素在食品、药品和化妆品领域有广泛用途。为获得生产β-胡萝卜素的微生物细胞工厂,本研究首先在酿酒酵母BY4742中过表达甲羟戊酸(MVA)途径的限速酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因及二萜化合物合成的关键酶牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶(GGPS)基因,来提高牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)的供给。在酿酒酵母底盘菌BY4742-T2的基础上整合来源于成团泛菌和红法夫酵母的β-胡萝卜素合成基因,比较酿酒酵母工程菌生产β-胡萝卜素的差别。结果表明提高酿酒酵母中HMGR和GGPS酶基因的表达能将工程菌中β-胡萝卜素的产量提高26.0倍。另外,来源于真核生物红法夫酵母的合成基因相比成团泛菌,更有利于酿酒酵母生产β-胡萝卜素。最终获得的酿酒酵母工程菌BW02能生产1.56 mg/g细胞干重的β-胡萝卜素,为进一步获得高产β-胡萝卜素细胞工厂提供基础。     

HCV 5A基因在Hela细胞中的稳定表达及对细胞生长的抑制现象

应用PCR技术从含有HCV(Hepatitis Cvirus)全长开放阅读框的质粒pBRTM／HCV 1-3011中获得NS5A全长基因片断,利用基因重组技术将其克隆至真核表达载体pcDNA3．1(-)中。通过酶切、PCR及测序鉴定NS5A基因已正确插入到pcDNA3．1(-)中,再利用脂质体介导转染Hela细胞,48h后传代并利用pcDNA3．1(-)质粒上的neo抗性基因加入G-418进行筛选。大约两周后,获得稳定表达的细胞株。经RT-PCR及western blot验证,证实HCV的NS5A基因在Hela细胞中已经获得了表达。在培养条件完全一致的条件下,表达NS5A基因的Hela细胞与pcDNA3．1(-)转染的细胞相比,生长速度明显变慢,其倍增时间约为35-36h,比对照组细胞增加了约50％,而转染pcDNA3．1(-)的细胞的倍增时间与正常Hela细胞则无明显差别,都为23-24h。从而证明HCV的NS5A蛋白具有抑制Hela细胞生长的作用。     

表达流感病毒神经氨酸酶基因的重组腺病毒的构建

通过RT-PCR方法扩增流感病毒神经氨酸酶基因,将其克隆到腺病毒穿梭载体pTrackCMV,此重组质粒与腺病毒DNA共转化大肠杆菌BJ5183,通过细菌内同源重组获得重组腺病毒DNA,将其转染293细胞获得重组腺病毒。经PCR证实目的基因已整合至腺病毒基因组中,western blot检测到神经氨酸酶的表达。重组病毒经筋鼻和灌胃两种途径免疫小鼠,结果表明2次免疫后滴鼻组和灌胃组均产生明显的免疫应答反应,滴鼻组的免疫效果优于灌胃组。     

草鱼出血病病毒基因组体内转录的研究

本文采用α-[~(32)p]ATP标记物在鱼肾细胞系(CIK)系统中,对草鱼出血病病毒(Grass carp hemorrhage virus,GCHV)基因组进行了体内转录的研究。通过放线菌素D抑制宿主细胞基因组的转录活动,从感染病毒细胞中分离出病毒的mRNA,分别采用液相杂交和Nortbern blot方法检查病毒mRNA的转录情况。试验结果表明,GCHV含有内源性转录酶,其基因组的转录活动是在病毒感染细胞后4小时开始,由早期基因所转录,8—10小时获得晚期基因的转录产物。这些mRNA的大小、数目大体上与病毒基因组一致。     

外源基因对水稻部分酶解小细胞团的转化研究(简报)

采用PEG法成功地将GUS及NPT-Ⅱ基因(质粒pBI 121)转入部分酶解的水稻小细胞团,获得表达,从而表明绕过原生质体,以部分酶解小细胞团作为水稻外源基因转化的另一种受体系统是切实可行的。由于细胞团易于操作,成活率高,对于某些原生质体培养特别困难的植物种属或基因型不失为行之有效的途径。     

三七细胞中共超表达FPS、SS对皂苷合成的影响

研究三七细胞中共超表达法呢基焦磷酸合酶(farnesyl pyrophasphate synthase,FPS)基因、鲨烯合酶(squalene synthase,SS)基因对三七细胞皂苷合成的影响.利用农杆菌EHA105将pCAMBIA1300S-FPS超表达载体转入已超表达SS的三七细胞内,双抗生素培养及基因组PC...     

HCV 5A基因在Hela细胞中的稳定表达及对细胞生长的抑制现象

应用PCR技术从含有HCV(Hepatitis C virus)全长开放阅读框的质粒pBRTM/HCV 1-3011中获得NS5A全长基因片断,利用基因重组技术将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-)中.通过酶切、PCR及测序鉴定NS5A基因已正确插入到pcDNA3.1(-)中,再利用脂质体介导转染Hela细胞,48h后传代并利用pcDNA3.1(-)质粒上的neo抗性基因加入G-418进行筛选.大约两周后,获得稳定表达的细胞株.经RT-PCR及western blot验证,证实HCV的NS5A基因在Hela细胞中已经获得了表达.在培养条件完全一致的条件下,表达NS5A基因的Hela细胞与pcDNA3.1(-)转染的细胞相比,生长速度明显变慢,其倍增时间约为35-36h,比对照组细胞增加了约50%,而转染pcDNA3.1(-)的细胞的倍增时间与正常Hela细胞则无明显差别,都为23-24h.从而证明HCV的NS5A蛋白具有抑制Hela细胞生长的作用.     

几丁质酶-葡聚糖酶双价基因导入滇型杂交稻恢复系提高稻瘟病抗性的研究

将含有菜豆(Phaseolus limensis)几丁质酶基因和烟草(Nicotiana tabacum)β-1,3-葡聚糖酶基因的pBLGC(16.5 kb)质粒用基因枪法导入滇型杂交稻(Oryza sativa L.ssp.japonica)恢复系"南29"中,总计获得93个转化再生植株,以β-1,3-葡聚糖酶基因制备探针对T1代株系进行Southern杂交分析,17个株系为杂交阳性,证实外源基因完整结构已整合到水稻基因组中;连续多代的PCR追踪检测证实外源基因已遗传至T4代;对所获得的6个PCR检测阳性T4代品系进行了稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)生理小种接种鉴定和稻瘟病大田诱发鉴定,结果表明,转基因品系对稻瘟病的抗性较受体对照大幅度提高,获得了稻瘟病新抗源,但不同品系稻瘟病抗性并不相同.     

表达流感病毒神经氨酸酶基因的重组腺病毒的构建

通过RT-PCR方法扩增流感病毒神经氨酸酶基因,将其克隆到腺病毒穿梭载体pTrackCMV,此重组质粒与腺病毒DNA共转化大肠杆菌BJ5183,通过细菌内同源重组获得重组腺病毒DNA,将其转染293细胞获得重组腺病毒.经PCR证实目的基因已整合至腺病毒基因组中,western blot检测到神经氨酸酶的表达.重组病毒经滴鼻和灌胃两种途径免疫小鼠,结果表明2次免疫后滴鼻组和灌胃组均产生明显的免疫应答反应,滴鼻组的免疫效果优于灌胃组.     

猪Ghrelin与IGF-1融合基因克隆和表达研究

目的本试验克隆和构建了猪Ghrelin(GL)与类胰岛素生长因子-1(IGF-1)的融合基因及其表达载体,研究它们在体外HEK293细胞的表达,为探索新型高效的动物生长和免疫调节生物制剂奠定了基础。方法利用基因重叠延伸PCR技术分别获得了GL、短链IGF-1基因及其融合基因(GI),双酶切后插入到VR1020真核分泌型表达载体上,分别命名为VGL、VRI和VGI。用壳聚糖(Chitosan,CS)和mPEG-PEI-CS分子包裹VRI、VGH和VGI制备纳米颗粒,先后进行HEK293细胞转染表达实验。结果成功克隆了猪Ghrelin基因及其与IGF-1的融合基因,构建了它们的真核表达载体,并进行了纳米分子包装,在HEK293细胞获得高效表达。结论猪Ghrelin和IGF-1融合基因及其真核载体的成功构建和表达,为进一步研发安全有效的新型生物制剂、促进动物的生长发育和免疫机能提供了新途径。     

微囊藻毒素去毒酶转基因模型的构建

根据已克隆的鲢鱼(Hypophthalmichthysmolitrix)微囊藻毒素去毒酶cDNA全序列设计特异引物,利用PCR方法获得鲢鱼微囊藻毒素去毒酶基因编码区,将该编码区与绿色荧光蛋白连接,分别构建融合表达载体pEGFP-N1-sGST和双顺反子表达载体pIRES2-EGFP-sGST。利用脂质体转染法将融合表达载体pEGFP-N1-sGST转染Hela细胞,60h后检测到绿色荧光基因表达;通过显微注射,将双顺反子表达载体pIRES2-EGFP-sGST注入斑马鱼(Daniorerio)受精卵,获得了转鲢鱼微囊藻毒素去毒酶基因斑马鱼,从而构建了微囊藻毒素去毒酶转基因模型。上述2种转基因模型的成功构建为进一步研究鲢鱼、鳙鱼(Aristichthysnobilis)、罗非鱼(Oreochromisnilotica)等淡水鱼类微囊藻毒素去毒酶基因调控元件、去毒分子机理及研发转基因鲢鱼、鳙鱼、罗非鱼等微囊藻毒素高效生物去毒器奠定了基础。     

牛朊蛋白基因prnp敲除载体的构建及真核细胞转染

利用正负筛选策略(Positive-negative selection,PNS)对中靶细胞进行富集是提高体细胞基因打靶效率常用的策略之一。将动物的朊蛋白基因prnp敲除,使其不能表达朊蛋白(传染性海绵状脑病的致病蛋白),从而使其具有抵抗Prion病感染的能力。本研究采用正负筛选策略,构建了牛prnp基因的双等位基因敲除载体,经内切酶Sac Ⅱ线性化后,再通过电穿孔转染牛胎儿成纤维细胞,分别用600μg/mL G418、200nmol/mL Ganciclovir(GCV)进行正负药物筛选,最终获得了176个药物抗性细胞克隆,进一步采用PCR、测序、间接免疫荧光试验及Western blotting试验对细胞克隆进行鉴定,结果表明,其中的9个细胞克隆为中靶细胞,证明牛prnp基因被成功敲除。本研究为牛prnp的敲除提供了可行性依据,并为体细胞核移植生产敲除朊蛋白基因的转基因动物提供供体细胞。     

抗HBsAg碱性磷酸酶双功能抗体的构建及对临床标本的初步检测

酶联免疫吸附试验(ELISA)在对微量抗原或抗体的检测中具有重要意义,酶标记物主要是抗体,其标记酶一般为辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP),常规的酶标抗体都是采用化学交联方法制备的,需要交联、纯化等多步蛋白质操作,易失活、成本高。随着分子生物学技术的发展,采用基因工程方法可将抗体基因和酶基因融合表达,获得既有抗体的抗原结合活性又有酶的催化活性的双功能抗体融合蛋白,不仅易于大量制备、成本低,而且提高了     

杜氏盐藻的耐盐机制研究进展和基因工程研究的展望

概述了杜氏盐藻 (Dunaliellasalina)的耐盐机制和基因工程的研究进展。盐藻的耐盐机制十分复杂 ,短时间内通过细胞体积的改变来调节渗透压平衡 ,之后通过甘油的合成与转化恢复细胞正常形态和大小。渗透调节过程中 ,还涉及到蛋白质的合成。cDNA文库和基因组文库已经建立 ;几种基因已被克隆 ,如碳酸酐酶基因和硝酸还原酶基因等 ;GUS(β_葡糖苷酸酶 )基因已成功地转入盐藻细胞内。另外 ,对盐藻的基因工程作了简单的展望     

人乳头瘤病毒HPV31型宫颈癌细胞模型的建立

宫颈癌与人乳头瘤病毒感染密切相关,建立宫颈癌实验模型可为宫颈癌的研究提供理想的模拟实验条件。我们通过应用基因重组技术,分别以HPV31型E6和E7基因为目的基因,通过原核表达、蛋白纯化和免疫小鼠等获得其特异性检测抗体。我们还通过构建E6和E7基因真核表达载体、转染C33A细胞、博莱霉素抗性筛选和表达检测等步骤,获得一种稳定的体外宫颈癌细胞系。经酶切鉴定及测序证实细胞基因组已重组插入质粒中的目的基因。我们已成功筛选到稳定的目的mRNA和蛋白表达的阳性细胞系,建立了稳定的人乳头状瘤病毒31型(HPV31)的宫颈癌细胞株,为研究宫颈癌提供了体外实验模型。