平滑肌细胞迁移的肌球蛋白轻链非磷酸化途径

为了阐明平滑肌细胞迁移存在肌球蛋白轻链非磷酸化调节途径,研究花生四烯酸(arachidonicacid,AA)对肌球蛋白轻链非磷酸化状态下平滑肌细胞迁移的影响及其相关的信号传导途径.经Boyden小室跨膜迁移实验发现,AA对培养的兔血管平滑肌SM3细胞具有明显的诱导迁移作用.然而,当预先用10μmolL肌球蛋白轻链激酶(myosinlightchainkinase,MLCK)特异性抑制剂ML7作用SM3细胞后,发现AA对SM3细胞仍然具有明显的诱导迁移作用,并呈剂量依赖性,这种诱导作用可被细胞外信号调节激酶12(ERK12)的特异性抑制剂PD98059或磷脂酶C(PLC)的特异性抑制剂U73122所拮抗.此外,Ⅱ型肌球蛋白抑制剂blebbistatin(BLB)可部分抑制“非磷酸化”状态下AA的诱导迁移作用.经Western印迹检测显示,10μmolLML7可完全抑制SM3细胞中20kD肌球蛋白轻链(MLC20)磷酸化,并且加入AA后MLC20仍为非磷酸化状态.应用免疫荧光染色法观察肌动蛋白在SM3细胞中分布的变化,发现在AA作用下肌动蛋白呈细胞边缘聚集现象,有伪足形成,细胞形态表现为迁移状态.预先用ML7作用后再加入AA,肌动蛋白的分布与上述结果相同.研究结果初步表明,在平滑肌细胞迁移的作用途径中,在MLC磷酸化调节途径受到抑制时,AA可诱导MLC非磷酸化的平滑肌细胞发生迁移,其分子机理可能与ERK12和PLC信号传导途径有关,非磷酸化的肌球蛋白直接参与了该迁移过程.     

尼古丁对血管平滑肌细胞NF-κB通路的影响

大量资料表明,尼古丁同冠心病等心血管疾病有着密切的相关性,但迄今为止,其致病的分子机理尚不完全明了。作者以体外培养的人脐静脉平滑肌细胞为研究对象,以尼古丁为刺激因素,采用Western blot和凝胶迁移等实验手段,观察了尼古丁对血管平滑肌细胞内NF-κB信号通路的影响。结果发现,尼古丁能够迅速激活NF-κB抑制蛋白激酶IKK,磷酸化NF-κB抑制蛋白IκB,活化转录因子NF-κB,导致下游靶基因actin转录增加。而且,这些作用可以被尼古丁受体阻断剂所阻断。这些结果从细胞信号转导的角度,对尼古丁导致动脉粥样硬化的分子机理做出了进一步的阐释。     

内皮细胞生长状态对血管平滑肌细胞增生迁移的影响

实验通过建立细胞共培养体系,探讨内皮细胞生长状态对血管平滑肌细胞增生迁移的影响及机制。检测指标包括~3H-TdR掺入、细胞周期、细胞迁移计数和α-SM-actin mRNA表达。结果显示,融合生长内皮使平滑肌细胞~3H-TdR掺入量明显降低,增加平滑肌细胞停留在G_0/G_1期的比例,上调平滑肌细胞α-SM-actin mRNA表达;而对数生长内皮细胞使平滑肌细胞~3H-TdR掺入量明显升高,促进平滑肌细胞由 G_0/G_1期进入G_2/M和S期,下调平滑肌细胞α-SM-actin mRNA表达。对照组平滑肌细胞在基础状态下存在少量迁移,对数增殖内皮细胞组平滑肌迁移数比对照组增高约4倍(P<0.01),而融合生长内皮细胞组平滑肌迁移数仅为对照组的0.5倍(P<0.05)。结果提示内皮细胞生长状态不同,对平滑肌细胞生物学特性的影响也不同,增殖期内皮明显促进平滑肌细胞增生迁移、下调平滑肌细胞α-SM-actin mRNA表达。     

Src介导骨桥蛋白诱导的血管平滑肌细胞黏附和迁移过程

为阐明酪氨酸激酶Src在整合素被骨桥蛋白(OPN)激活所触发的细胞黏附和迁移信号途径中所起的作用,应用Src特异性抑制剂PP2阻断Src,观察OPN诱导的血管平滑肌细胞(VSMC)黏附和迁移活性的改变,并利用免疫沉淀检查PP2对整合素下游信号分子黏着斑激酶(FAK)和整合素偶联激酶(ILK)磷酸化及其相互作用的影响。结果显示,PP2可明显抑制OPN诱导的VSMC黏附和伤口愈合(黏附和迁移活性分别为对照组的76.6%和33.8%);OPN可显著诱导FAK磷酸化(磷酸化水平达对照组的1.9倍),促进ILK去磷酸化,并使FAK与ILK的结合减少(降至对照组的46.4%)。10μmol/LPP2可明显抑制OPN诱导的FAK磷酸化、拮抗OPN诱导对ILK的去磷酸化作用、促进FAK与ILK之间的结合。研究结果表明,Src作为OPN-整合素-FAK信号途径中的信号分子,通过影响FAK和ILK的磷酸化以及两者之间的相互作用来调节VSMC的黏附和迁移活性。     

影响主动脉平滑肌细胞迁移的因素

平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)的迁移对血管发育、动脉粥样硬化和术后再狭窄等起到关键性的作用。主要从激发VSMC迁移的关键炎性细胞因子、细胞间相互作用的核心成员、microRNA、细胞骨架和上述各因素的迁移信号通路这几方面来综述VSMC的迁移。     

外加直流电场对血管平滑肌细胞形态及迁移行为的影响

在外加直流电场(electricalfields,EFs)作用下血管平滑肌细胞(VSMCs)膜表面细胞生长因子受体表达发生明显的变化,并影响细胞形态、迁移的特性。通过EFs干预装置干预体外培养的大鼠主动脉VSMCs,记录和分析细胞图像,研究不同强度电场、不同作用时间下VSMCs迁移和细胞形态的变化,并用免疫细胞化学或免疫荧光染色方法检测与VSMCs迁移相关的血小板衍化生长因子受体(PDGFR)、血管紧张素II1型受体(AT1R)和2型受体(AT2R)等受体的表达情况,研究EFs影响VSMCs形态及迁移的机制。研究结果提示,在EFs干预作用下,VSMCs膜PDGFR表达增加,部分细胞呈不对称分布,在EFs阴极面较集中;细胞中AT1R表达亦增加,但无明显不对称分布现象;AT2R表达没有改变;EFs长时间作用下,培养的VSMCs有明显的电场趋化性,细胞向阴极迁移的距离明显高于无EFs作用对照组,细胞膜向阴极方向伸展,发生形状改变,定向迁移依赖于EFs强度。EFs作用下,部分细胞生长因子受体的表达上调和重分布,可能与细胞定向迁移的启动和维持有关。     

视黄醇结合蛋白4 对血管平滑肌细胞迁移和增殖的影响及机制

目的:研究视黄醇结合蛋白4(Retinol-binding protein 4,RBP4)对血管平滑肌细胞(SMCs)迁移和增殖的影响及分子机制。方法:体外培养大鼠主动脉SMCs,采用划痕实验及Boyden's迁移小室实验观察RBP4对SMCs迁移的影响,采用免疫印迹实验技术检测Akt的磷酸化水平,采用Boyden's小室实验观察PI3K抑制剂LY294002预处理细胞对RBP4促SMCs迁移的影响,应用MTT比色实验结合流式细胞仪技术,检测RBP4对SMCs细胞增殖及细胞周期的影响。结果:RBP4呈剂量依赖性诱导大鼠血管SMCs迁移(P0.05);RBP4处理细胞显著增加了Akt磷酸化;PI3K抑制剂LY294002预处理细胞则显著抑制了RBP4的促迁移作用(P0.05);RBP4处理有增加SMCs数量的趋势,且可轻微阻滞细胞进入S期,但未达到统计学显著性(P0.05)。结论:RBP4通过PI3K-Akt通路诱导大鼠血管SMCs迁移,对细胞增殖及细胞周期则无显著影响。     

非磷酸化肌球蛋白在血小板衍生生长因子诱导的血管平滑肌细胞迁移中的作用

为了阐明非磷酸化肌球蛋白在平滑肌细胞迁移中的作用,研究探讨了非磷酸化肌球蛋白是否介导了血小板衍生生长因子(PDGF)诱导豚鼠脑基底动脉平滑肌细胞(GbaSM-4)的迁移。研究结果显示,20ng/ml以下剂量的PDGF可诱导GbaSM-4细胞发生迁移,此时肌球蛋白轻链(MLC20)磷酸化水平无变化。该迁移作用可被肌球蛋白特异性抑制剂blebbistatin所拮抗。应用RNA干扰技术抑制肌球蛋白轻链激酶表达,经免疫印迹检测经果显示,MLC20的磷酸化水平发生了显著下降;但对PDGF诱导的迁移作用无影响;在RNA干扰后blebbistatin也可抑制其迁移作用。体外ATP酶活性测定结果显示,blebbistatin对从平滑肌中提取的非磷酸化肌球蛋白的ATP酶活性有明显的抑制作用,其主要作用位点位于肌球蛋白头的头部S1。上述结果提示,非磷酸化的肌球蛋白参与了PDGF诱导的平滑肌细胞迁移。     

粘着斑相关非激酶对骨桥蛋白促血管平滑肌细胞迁移的抑制作用及分子机制

为阐明整合素 β3 粘着斑激酶 (FAK)信号途径在骨桥蛋白 (OPN)诱导血管平滑肌细胞(VSMC)迁移中的作用 ,用FAK磷酸化特异性抑制剂粘着斑相关非激酶 (FRNK)选择性阻断FAK磷酸化 ,观察对OPN 整合素 β3 相互作用所激活的FAK信号通路的影响及其与OPN诱导VSMC迁移之间的关系 .外源性FRNK在VSMC中的过表达可显著抑制OPN诱导的VSMC迁移 ,使跨膜迁移细胞数下降 5 0 5 8% (P <0 0 5 ) .OPN刺激不但明显诱导FAK表达 ,而且还促进其磷酸化 .外源性FRNK对OPN诱导的FAK磷酸化具有显著抑制作用 ,使磷酸化型FAK水平比相应对照细胞下降5 9 1% ,但其对FAK表达不产生明显的影响 .FRNK还具有下调整合素 β3 表达的作用 ,免疫荧光细胞化学分析结果显示 ,在转染FRNK的VSMC中 ,粘着斑蛋白的磷酸化水平降低 ,粘着斑数量明显减少 .结果提示 ,整合素 β3 FAK是介导VSMC迁移的重要信号途径 ,外源性FRNK通过下调 β3 表达、抑制FAK磷酸化和减少粘着斑蛋白磷酸化及粘着斑形成等机制 ,减弱OPN刺激信号的跨膜转导及沿胞内途径传递 ,发挥抑制OPN促VSMC迁移的效应 .     

ROCK Ⅰ/Ⅱ基因下调对血管平滑肌细胞迁移及增殖的影响

目的:探讨ROCK亚型ROCK Ⅰ和ROCKⅡ对血管平滑肌细胞(A7r5)迁移及增殖的影响.方法:利用Western blot技术检测ROCK Ⅰ和ROCKⅡ蛋白在A7r5细胞中的表达水平;利用siRNA技术使ROCK Ⅰ和ROCKⅡ基因表达分别下调,并检测基因下调后蛋白表达水平;利用Boyden小室法,观察ROCK Ⅰ和ROCKⅡ基因下调后及RocK特异抑制剂Y-27632对PDGF诱导的A7r5细胞迁移的影响:使用MTT法检测ROCK Ⅰ和ROCKⅡ基因下调后对A7r5细胞生长曲线的影响.结果:ROCK Ⅰ和ROCKⅡ在A7r5细胞中的蛋白表达水平不同,ROCKⅡ较ROCK Ⅰ的表达水平高4倍;通过对A7r5细胞进行ROCK Ⅰ和ROCKⅡ siRNA转染,使二者蛋白表达水平分别下调83.4%和94.7%;基因表达下调后,ROCK Ⅰ明显抑制了PDGF诱导的A7r5细胞的迁移,而ROCKⅡ无明显影响,Y-27632也抑制了A7r5细胞的迁移;ROCK Ⅰ和ROCKⅡ基因下调后对A7r5细胞生长曲线的影响无明显差别.结论:ROCK Ⅰ在血管平滑肌细胞迁移过程中起主导作用,ROCK Ⅰ和ROCKⅡ对血管平滑肌细胞的增殖作用无明显差异.     

同型半胱氨酸对大鼠血管平滑肌细胞增殖的作用

血中同型半胱氨酸（ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ,ＨＣＹ）浓度的升高已成为动脉粥样硬化发生的一个独立危险因子．为进一步阐明ＨＣＹ促进血管平滑肌细胞（ｖａｓｃｕｌａｒｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌｓ,ＶＳＭＣｓ）增殖,从而引起动脉粥样硬化发生的机理．本实验采用细胞计数、３Ｈ－ＴｄＲ参入、细胞周期分析、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交方法证明,一定剂量的ＨＣＹ可促进离体培养的ＷＫＹ大鼠血管平滑肌细胞增殖,使其ＤＮＡ合成增加,细胞周期中Ｓ期细胞所占比例增加４３％,并促进ｃ－ｍｙｃ与ｃ－ｆｏｓ原癌基因ｍＲＮＡ表达增加．提示ＨＣＹ可能通过促进ＶＳＭＣｓ增殖而诱发动脉粥样硬化     

平滑肌肌球蛋白轻链激酶的非激酶作用及对ATP 酶活性的调节

肌球蛋白轻链激酶（myosin light chain kinase, MLCK）具有激酶活性和非激酶活性,在平滑肌收缩过程中起着关键酶调控的作用.为探寻MLCK的非激酶活性区域对MLCK活性的影响,以进一步阐明MLCK的非激酶活性在调节平滑肌收缩过程中的分子机制.采用PCR技术构建MLCK部分氨基酸缺失的重组表达载体pGEX-F6-5/D,经大肠杆菌表达得到可溶性GST融合蛋白,利用SDS-PAGE及Western 印迹鉴定表达的MLCK在细胞中的分布,结果还显示,提取液的上清和沉淀中均有MLCK片段的表达.运用亲和层析技术分离并纯化删除前、后表达的MLCK片段（F6.5和F6-5/D）,经谷胱甘肽琼脂糖凝胶 4B 纯化,SDS-PAGE鉴定显示为单一表达条带.应用EnzChek磷分析试剂盒和孔雀绿两种方法分别测定不同浓度的MLCK对非磷酸化肌球蛋白Mg²⁺-ATP酶活性的影响.两种MLCK的片段均具有激活ATP酶活性的作用,并随MLCK浓度的增加,酶的活性增加.比较删除前后不同MLCK片段对ATP酶活性的影响结果显示,删除MLCK片段1002位丙氨酸至1019位亮氨酸后,对ATP酶的激活作用较删除前明显降低,表明删除的部分氨基酸序列为MLCK非激酶活性所必需的区域.利用电镜技术观察到MLCK片段（F6.5）使非磷酸化肌球蛋白构象发生明显的变化.加入MLCK片段后肌球蛋白的构象由非活性型转化为活性型,并且MLCK片段还具有促进肌球蛋白单体形成肌丝的作用.     

黄芩苷通过降低活性氧生成抑制血管平滑肌细胞伪足形成和迁移

已知黄芩苷（baicalin）通过削弱肌动蛋白相关蛋白（actin-related protein, Arp）2/3复合物的活性抑制血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell, VSMC）伪足形成和迁移,然而,其抑制该信号途径的机制尚不明确。本研究证明,黄芩苷通过抑制VSMC活性氧（reactive oxygen species,ROS）生成降低Arp2/3活性,发挥阻止细胞伪足形成和迁移的功能。分别利用TRITC 鬼笔环肽和ROS荧光探针标记VSMCs,结果显示,黄芩苷能显著抑制血小板源性生长因子（platelet derived growth factor, PDGF）-BB诱导的VSMC伪足形成和迁移,伴有ROS生成减少。用超氧物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）清除胞内过氧化物后,PDGF-BB引发的VSMC伪足形成被逆转,且该过程与降低皮层肌动蛋白微丝（F-actin）成核蛋白Arp2/3活性有关。免疫沉淀分析结果进一步表明,黄芩苷降低p47phox磷酸化水平,与ROS生成减少相一致。体内的实验也表明,黄芩苷（70 mg/kg/d）能有效抑制球囊损伤诱导的大鼠颈总动脉ROS生成。以上结果表明,黄芩苷通过抑制NADPH氧化酶介导的ROS生成,降低细胞皮质区F-actin成核活性,阻止细胞伪足形成、迁移,进而发挥血管保护作用。     

PDGF-BB下调血管平滑肌标志物SM22α表达的机制

血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell,VSMC）表型转化是血管重塑性疾病的细胞病理学基础,血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor,PDGF）-BB抑制平滑肌分化标志基因表达、加速其降解,是VSMC表型转化的关键。该研究用PDGF-BB刺激VSMC诱导细胞发生表型转化,利用Western blot和免疫共沉淀等技术,检测PDGF-BB对早期分化相关基因平滑肌22 alpha（smooth muscle 22 alpha,SM22α）磷酸化与泛素化的影响。实验结果显示,PDGF-BB促进VSMC增殖;上调增殖相关蛋白PCNA的表达,下调分化相关蛋白SM22α与SMα-actin的表达;诱导SM22α发生磷酸化和泛素化,而且,该过程与SM22α水平下调具有时相相关性;抑制剂阻断分析证实,ERK和PKC参与介导了PDGF-BB诱导的SM22α磷酸化。以上结果提示,在VSMCs表型转化中,PDGF-BB可能是通过激活ERK-PKC信号通路,促进SM22α的磷酸化和泛素依赖的蛋白质降解。     

花生四烯酸诱导肌球蛋白磷酸化被抑制的平滑肌细胞 迁移的信号传导途径

在应用肌球蛋白轻链激酶特异抑制剂ML-7抑制了肌球蛋白轻链磷酸化后,花生四烯酸(arachidonic acid,AA)仍可诱导兔血管平滑肌细胞（SM3）发生迁移.为了进一步阐明其信号传导途径,应用多种信号抑制剂,采用免疫印迹、Boyden小室和提取细胞膜蛋白等实验方法,对上述迁移作用的信号传导途径进行了深入的研究.结果显示,PTX（Gi蛋白抑制剂）、U73122（PLC抑制剂）、staurosporine (PKC抑制剂)、PD98059（ERK1/2抑制剂）和SB203580（p38抑制剂）分别可拮抗上述AA诱导的SM3细胞迁移作用,而SP600125（JNK抑制剂）的作用较弱.免疫印迹结果显示,AA可提高SM3细胞中PKC(ε)、ERK1/2、p38和JNK信号的磷酸化水平,呈时间依赖性, PTX或U73122可抑制上述作用;staurosporine可抑制由AA 引起的ERK1/2和JNK的磷酸化水平增强,但对p38的磷酸化水平无影响.还发现AA可促进PLCβ2的细胞膜移位, PTX可抑制其作用.上述结果表明,当肌球蛋白轻链的磷酸化被抑制后, AA可通过Gi蛋白的活化促进PLCβ2向细胞膜移位,进而通过激活PKC(ε)、ERK1/2、p38和JNK等信号转导途径而诱导SM3细胞发生迁移