中国人促红细胞生成素cDNA的克隆及其在COS—7细胞中的表达

利用PCR技术,以中国人促红细胞生成素(EPO)次全基因组为模板,进行了基因修补和重组,克隆出EPO cDNA全序列。同时发现中国人EPO cDNA与国外的克隆比较有一个核苷酸的差异,导致第62位氨基酸是丝氨酸,不是亮氨酸。将人EPO cDNA基因插入表达载体pSV2-dhfr中的不同克隆位点,构建了6种不同的转移载体质粒,即pSV2-dhfr/F1,pSV2/N2,pSV2-dhfr/F3,pSV2-dhfr/P4,pSV2-dhfr/G1和pSV2-dhfr/G3。将它们分别转染导入COS-7细胞,结果表明6种转移载体质粒转染的细胞上清液都有明显的EPO活性。人EPO cDNA基因转移载体质粒在COS-7细胞中的表达水平高于人次全EPO基因组转移载体质粒。     

人促红细胞生成素基因组基因和cDNA的克隆及其在COS－7细胞中的表达

利用ＰＣＲ技术,从正常人胎肝染色体ＤＮＡ中克隆到长度为１５７２ｂｐ的人促红细胞生成素（ＥＰＯ）基因组基因片段,它包含除第一个外显子和第一个内含子外所有外显子及内含子。再人工合成１３ｂｐ外显子１的编码区,并与１５７２ｂｐ片段拼接,从而得到除第一个内含子的人促红细胞生成素基因组基因。将克隆得到的ＥＰＯ基因插入载体ｐＳＶ２－ｄｈｆｒ得到ｐＳＶ２－ＥＰＯ表达载体,转染ＣＯＳ－７细胞后获得高效表达。利用自行研制的小鼠抗人ＥＰＯ单抗及兔抗人ＥＰＯ多抗,对表达产物进行ＥＬＩＳＡ定量测定,细胞分泌ＥＰＯ量高达２５１±７Ｕ／ｍｌ．Ｋｒｙｓｔａｌ法测得体外生物活性２４１．５±６．５Ｕ／ｍｌ．用ＥＰＯ单抗免疫沉淀结合ＳＤＳ－ＰＡＧＥ对转染细胞的表达产物做了进一步鉴定,清晰地看到了ＥＰＯ条带。从高效表达ＥＰＯ的转染细胞中分离纯化ｍＲＮＡ,用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增并克隆到ＥＰＯ的ｃＤＮＡ,这为ＥＰＯ在其它系统中的表达及ＥＰＯ的功能与结构的研究打下了基础。     

人促红细胞生成素基因的合成及在大肠杆菌中的表达

人促红细胞生成素(简称hEPO)是一种能够促进祖红细胞分化发育并进而促进红细胞生成的细胞生长因子,它在临床上可用以治疗某些贫血病人特别是由于慢性肾衰所引起的肾性贫血^〔1－3〕．hEPO是一种由166个氨基酸组成的糖基化蛋白质．它的前体还带有27个氨基酸的信号肽^〔4－6〕。有两对由Cys7-Cys161和Cys29－Cys33组成的二硫键,其糖基化位点为Ash--24。Ash一38．Asn一83和Ser一126^〔7－8〕。由于天然来源hEPO的量极少．因此通过基因工程的手段是当前获得大量hEPO的较好的途径^〔9－10〕。我们在前文中曾经报道用单链方法合成天花粉胰蛋白酶抑制荆基因〔11〕以及用单链和PCR相结合来合成绿豆胰蛋白酶抑制荆基因的方法〔12〕．我们在合成hEPO基固(包括带有信号肽的hEPO基因)时也采用了这两种方法：合成的hEPO基因在大脑杆菌、CHO细胞和昆虫细胞中均得到表达。本文报道hEPO基因的合成及在大肠杆菌中的表达结果。     

人促红细胞生成素的表达调控

人促红细胞生成素是控制红细胞生长发育的一种重要的细胞因子,在人体内具发育阶段异性、分泌的诱导性等特点,是研究真核基因表达的理想模型。本文从细胞水平的调控、基因结构以及基因３′和５′侧翼序列的调控元件对人促红细胞生成素表达的影响作用进行了讨论。     

中国人红细胞生成素cDNA克隆与高效表达

以中国人正常胎肝为原料提取总RNA,逆转录合成cDNA与pCR3载体相连接,构建成pE／C表达质粒。序列鉴定结果表明,cDNA序列与国内外已报导的相比,除第2个密码子的第3个碱基系引物设计所致差异外,其余部分完全相同。利用脂质转染法将质粒转入中国白鼠卵巢细胞,获得能高效稳定表达重组人红细胞生成素的工程细胞。     

人促红细胞生成素基因组基因的克隆及全序列分析

为了克隆到全长的人促红细胞生成素基因,从而在真核系统中及转基因动物乳腺中进行表达,从一个中国人的血细胞中提取基因组ＤＮＡ,构建了不完全基因组噬菌体文库,文库效价为５×１０４．这种文库的构建方法是用ＢａｍＨⅠ对基因组ＤＮＡ进行完全酶切,回收１０．５ｋｂ左右的酶切片段,插入到λ－噬菌体ＥＭＢＬ３载体中．筛选文库所使用的探针是用ＰＣＲ方法从基因组ＤＮＡ模板中扩增的５５６ｂｐ的ＥＰＯ基因片段．从该文库中筛选到了一个含有完整ＥＰＯ基因的插入片段长度为１２．５ｋｂ的阳性克隆．经全序列分析证实,所克隆的ＥＰＯ基因编码正确,但在５′－侧翼及第一内含子处与国外发表的序列相比较,发现两处核苷酸差异,这两个核苷酸的差异改变了５′－调控区的两个小的开放阅读框——ＯＲＦ１和ＯＲＦ３,其在基因表达调探方面的作用值得进一步探讨．     

人促红细胞生成素基因在番茄中的表达

通过子叶与农杆菌（ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＡＧＬ１）共培养,将表达载体ｐＨＬＰＥ中的人促红细胞生成素（ｈＥＰＯ,一种人来源的典型糖蛋白）基因（ｅｐｏ）导入番茄,然后用卡那霉素进行筛选,获得了抗性植株。经点杂交和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹分析,证明部分抗性植株中整合了ｅｐｏ基因。通过对转基因番茄植株叶片的粗提蛋白进行ＥＰＯＥＬＩＳＡ检测,结果表明,ｈＥＰＯ在番茄中的表达量为约４００ｐｇ／ｇ叶片。经用转基因植株叶片粗提蛋白饲喂依赖于ＥＰＯ的ＴＦ１细胞,表明番茄ＥＰＯ具有体外（ｉｎｖｉｔｒｏ）生物活性,这暗示用植物生产的ＥＰＯ可作为体外药物加以应用。     

促红细胞生成素及其基因治疗的研究进展

在简要回顾ＥＰＯ研究进展的基础上，较系统地介绍了ＥＰＯ在贫血基因治疗研究中的进展，最后，对该研究领域存在的问题及前景进行了总结和展望。     

母乳中的促红细胞生成素的生理功能

母乳中存在促红细胞生成素.该文介绍母乳中促红细胞生成素的含量以及来源,并着重探讨促红细胞生成素对幼仔的生理作用.     

红细胞生成素cDNA在中国仓鼠卵巢细胞中的稳定表达

将(?)红细胞生成素(EPO)cDNA构建的重组表达质粒用电穿孔法引入COS-7细胞,ELISA和红系集落测活结果表明,该重组质粒在哺乳动物细胞中能够表达有生物活性的红细胞生成素。进一步将其转染CHO-dhfr~-细胞,经氨甲喋呤(MTX)加压扩增,混合细胞中各克隆表达水平比较一致,细胞的平均表达水平为2-3μg/10~6 Cells/24hr。细胞冻存后复苏其表达水平与冻存前一致,表明外源基因整合稳定。     

促红细胞生成素和受体在前列腺癌组织中共同过表达的研究

目的:探讨促红细胞生成素(EPO)和受体(EPOR)在前列腺癌(PCa)组织中的表达,并进一步阐述EPO和EPOR在前列腺癌发生发展中所起的作用。方法:应用免疫组化SP法检测30例前列腺癌根治术组织标本中癌与增生(BPH)组织的EPO和EPOR表达及30例正常前列腺组织(NP)中的EPO和EPOR表达。前列腺癌分级采用Gleason评分。半定量EPO和EPOR评分分析免疫组化结果。同时根据细胞染色强度区分为过表达和正常表达。统计学分析采用配对样本比较Wilcoxon的秩和检验及线形回归分析。结果:大部分前列腺癌均可见EPO和EPOR同时过表达,但是前列腺增生组织只有EPO过表达;正常前列腺组织没有EPO和EPOR过表达。前列腺癌和良性前列腺增生的EPO免疫组化评分中位数为2.38和0.93(P<0.01);前列腺癌和良性前列腺增生的EPOR免疫组化评分中位数为2.50和0.68(P<0.01)。前列腺增生和前列腺癌的EPO和EPOR表达密切相关,但是前列腺癌的Gleason评分和EPO以及EPOR评分没有相关性(P值均>0.05)。结论:EPO和EPOR同时过表达促进前列腺癌发生发展,但是相对于EPO的过表达,EPOR过表达是前列腺癌发生更为重要的早期事件;前列腺癌组织中EPO和EPOR表达差异,提示除了缺氧外,可能还有其它机制参与EPOR的过表达。     

促红细胞生成素的抗炎症作用研究进展

促红细胞生成素是一种造血因子,临床中广泛应用于治疗各种原因造成的贫血。近年的研究发现,EPO具有多种非造血生物作用．其中对各组织以及全身炎症反应的保护作用已成为目前的研究热点之一。但目前EPO抗炎症作用相关的机制尚不明确。本文对EPO的抗炎症作用及其可能机制作一综述,并对EPO在临床中的应用前景进行了展望。     

用三步法纯化重组人促红细胞生成素

在生物反应器中培养中国仓鼠卵巢细胞—促红细胞生成素(CHO-EPO)C2细胞株,培养上清液中重组人促红细胞生成素(rHuEPO)表达水平达2000～3000U/ml。培养上清经过三步纯化:第一步为反相柱色谱,可将样品浓缩约96.7％,其收集液经充分透析后进行第二步的DEAE-离子交换色谱,最后进行分子筛色谱,总回收率为30％以上,经纯化的rHuEPO比活性为1.5×10~8U/g蛋白,SDSPAGE一条带,扫描测试纯度达98％以上。     

促红细胞生成素在神经损伤中的作用

促红细胞生成素是控制红细胞生成的细胞因子,促红细胞生成素及受体在中枢和外周神经系统均有表达,发挥神经保护作用,有潜在的临床应用前景.本文对促红细胞生成素在外周神经损伤中的作用及机制作一综述,以求为外周神经损伤治疗提供新思路.     

促红细胞生成素基因表达载体的构建及其在CHO细胞中表达的研究

用从基因文库中所克隆的促红细胞生成素（ＥＰＯ）基因组基因,构建了３种由不同启动子调控的表达载体——ｐＯＰ１３／ＥＰＯ,ｐＲＳＶ／ＥＰＯ,ｐＣＭＶ／ＥＰＯ,在这３个表达载体的构建过程中对基因的转录起始效率、内含子的剪接、５′非翻译区和３′非翻译区对基因表达的影响等因素都加以考虑．用脂质体转染法分别将上述３个载体导入ＣＨＯ细胞,经瞬时表达,用ＥＬＩＳＡ方法检测,表达量分别为１９０ｍＩＵ／ｍｌ、１６０ｍＩＵ／ｍｌ、４４７ｍＩＵ／ｍｌ．用表达载体ｐＯＰ１３／ＥＰＯ转染ＣＨＯ－Ｋ１２细胞,在４００μｇ／ｍｌ的Ｇ４１８浓度下筛选稳定表达细胞克隆,获得了表达量约为１６０ＩＵ／１０６细胞（４８ｈ）的Ｃ１０细胞株．表达产物经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测发现了ＥＰＯ阳性条带．用ＴＦ－１细胞对ＥＰＯ进行了生物活性检测,初步证实所表达的ＥＰＯ有生物活性．     

促红细胞生成素在脑缺血动物模型治疗中的研究进展

促红细胞生成素是一种促进红系造血前体细胞增殖、分化的细胞因子,主要作用为促进红细胞增殖,应用于临床各种贫血治疗。随着研究进展,学者发现促红细胞生成素为一种多功能营养因子及神经保护因子,具有调节中枢神经系统发育、神经营养及神经保护作用。脑缺血性卒中实验研究显示,促红细胞生成素可有效改善中枢神经系统疾病所致的神经功能缺损,本文主要概述促红细胞生成素在脑缺血性卒中动物模型的研究进展,及其发挥神经保护作用所经由的分子机制。相信随着实验研究进展,其在脑缺血性卒中临床治疗方面将拥有更广阔的前景。     

重组人促红细胞生成素纯化工艺的优化

采用堆积床生物反应器,用无血清培养基培养分泌重组人促红细胞生成素（rhEPO）的工程细胞株ZK9703.所收集的上清,采用阴离子交换层析－反相层析－分子筛层析三步纯化工艺路线,分别用Q－Sepharose XL-C4-S-200（方法Ⅰ）和DEAE Sepharose FF-Source-S-200(方法Ⅱ）纯化3批产品,所得EPO纯度达98％以上,体外比活性大于1.3^10^5IU/mg。方法Ⅰ、方法Ⅱ纯化过程的EPO体外活性回收率分别为23.56%和28.57%。本纯化方法Ⅱ工艺纯化日程短,分离效果好,EPO体内、体外活性回收率较高,更适合于大规模生产重组人促红细胞生成素。     

人促红细胞生成素在转基因小鼠乳汁中表达

将山羊的β乳球蛋白启动子连接人促红细胞生成素基因,构建转基因表达载体。通过显微注射的方法转基因小鼠。经PCR斑点杂交和Southern杂交检测验证,获得4只转基因阳性小鼠,其中3只母鼠哺乳期收集乳汁,经EpoELISA检测为阳性。对4组转基因阳性小鼠的部分子代母鼠,经PCR和Southern杂交分析,又鉴定出6只获得遗传的阳性G1代母鼠以Dot-ELISA的方法检测,其中两只G1代母鼠乳汁中的Epo含量为0.5μg/mL。实验证实,867bp的β乳球蛋白启动子可以指导人促红细胞生成素在小鼠乳汁中表达。