美洲斑潜蝇SS PCR检测技术研究

【背景】美洲斑潜蝇是一种严重威胁瓜果蔬菜、烟草、棉花等经济作物和花卉生产的入侵性害虫。由于潜叶蝇类害虫体型较小、生活方式隐蔽、形态相似,本文针对其难以快速准确地进行形态鉴别的问题,以美洲斑潜蝇为研究对象,以菜田常见的4种潜叶蝇类害虫为参照,采用种特异性PCR方法（species specific PCR, SS PCR）,研究其快速分子检测鉴定技术。【方法】调用GenBank中一段936 bp的美洲斑潜蝇线粒体DNA（mtDNA）细胞色素氧化酶亚基Ⅰ基因（CO[KG-*2]Ⅰ）的序列（GenBank登录号为EU219613）,并根据此基因片段的碱基序列设计引物1对,其扩增片段大小为294 bp。【结果】种特异性检验结果显示,该引物只对美洲斑潜蝇的CO[KG-*2]Ⅰ基因具有扩增能力,对其他种类如南美斑潜蝇、三叶斑潜蝇、葱斑潜蝇、豌豆潜叶蝇等没有扩增能力。该引物不仅对成虫具有良好的扩增效果,对蛹、幼虫以及单粒卵也具有同样的扩增效果,其最低检出阈值为1/3840头成虫。【结论与意义】SS PCR技术体系可用于美洲斑潜蝇的鉴定识别与检测监测,对阻止其进一步扩散蔓延具有重要意义。     

美洲斑潜蝇SS-PCR检测技术研究

【背景】美洲斑潜蝇是一种严重威胁瓜果蔬菜、烟草、棉花等经济作物和花卉生产的入侵性害虫。由于潜叶蝇类害虫体型较小、生活方式隐蔽、形态相似,本文针对其难以快速准确地进行形态鉴别的问题,以美洲斑潜蝇为研究对象,以菜田常见的4种潜叶蝇类害虫为参照,采用种特异性PCR方法（species-specific PCR,SS-PCR）,研究其快速分子检测鉴定技术。【方法】调用GenBank中一段936bp的美洲斑潜蝇线粒体DNA（mtDNA）细胞色素氧化酶亚基Ⅰ基因（COⅠ）的序列（Gen-Bank登录号为EU219613）,并根据此基因片段的碱基序列设计引物1对,其扩增片段大小为294bp。【结果】种特异性检验结果显示,该引物只对美洲斑潜蝇的COⅠ基因具有扩增能力,对其他种类如南美斑潜蝇、三叶斑潜蝇、葱斑潜蝇、豌豆潜叶蝇等没有扩增能力。该引物不仅对成虫具有良好的扩增效果,对蛹、幼虫以及单粒卵也具有同样的扩增效果,其最低检出阈值为1/3840头成虫。【结论与意义】SS-PCR技术体系可用于美洲斑潜蝇的鉴定识别与检测监测,对阻止其进一步扩散蔓延具有重要意义。     

不同地理种群美洲斑潜蝇及近缘种的rDNA-ITS1序列分析和比较

【目的】通过对美洲斑潜蝇Liriomyza sativae Blanchard 不同地理种群及近缘种间的核糖体DNA第一内转录间隔区（rDNA-ITS1）进行比较,分析美洲斑潜蝇不同地理种群间的遗传分化情况,并为美洲斑潜蝇与近缘种间提供分子鉴别标记。【方法】用PCR产物直接测序法及克隆测序法对我国美洲斑潜蝇8个地理种群的rDNA-ITS1序列进行测序,并调用GenBank中3个近缘种的rDNA-ITS序列,运用软件MEGA3.1对美洲斑潜蝇不同地理种群及近缘种间的rDNA-ITS1序列进行分析。【结果】美洲斑潜蝇8个地理种群间的分化程度较低,只有8个变异位点,遗传距离都在0.02以下,但4个近缘种间的碱基差异显著,遗传距离为0.149～0.390,有126个变异位点,12个美洲斑潜蝇特异性识别位点。【结论】虽然基于rDNA-ITS1序列所显示的美洲斑潜蝇各地理种群之间的遗传分化很小,但是其分化趋势与地理分布基本相吻合;得到的12个特异性识别位点不仅可以作为美洲斑潜蝇与其近缘种间鉴别的分子标记,而且可为今后设计鉴别性PCR引物提供重要的参考依据。     

温、湿度对南美斑潜蝇和美洲斑潜蝇羽化的影响

在实验条件下 ,研究了温湿度对南美斑潜蝇Liriomgzahuidobrensis和美洲斑潜蝇Liriomgzasativae羽化的影响。结果表明 ,温度对 2种斑潜蝇日羽化节律有显著的影响。随温度的升高 ,成虫的日羽化时段相应缩短 ,日羽化高峰期相应提前。且 2种斑潜蝇的羽化均集中在 1 2 :0 0之前。 2种斑潜蝇羽化所需要的最适温度 :南美斑潜蝇为 2 0℃ ,美洲斑潜蝇为 2 5℃ ;羽化所需要的最适相对湿度 :南美斑潜蝇为90 % ,美洲斑潜蝇为 1 0 0 %。     

福州郊区美洲斑潜蝇、南美斑潜蝇寄主植物初步名录

本记录了福州郊区美洲斑潜蝇、南美斑潜蝇寄主植物的初步名录。发现该地区美洲斑潜蝇可取食20科85种植物,南美斑潜蝇可取食20科73种。最后讨论了这两种斑潜蝇的主要寄主作物和杂草,并提出套种和清除田间杂草的农防措施;斑潜蝇的适应性很强,寄主范围正逐步扩大,应密切关注其动态。     

温度对美洲斑潜蝇及南症状斑潜蝇种群增长的影响

在恒温条件下观察了美洲斑潜蝇和南美斑潜蝇实验种群的发育、存活及繁殖情况,拟合了两种斑潜蝇发育速率与温度之间的关系模型,求出了各发育阶段的发育起点温度及有效积温,组建了不同温度下两种斑潜蝇实验种群的生殖力表,计算了主要的生命表参数。结果表明,温度对两种斑潜蝇的发育、存活、繁殖均有显著的影响,且两种斑潜蝇对温度的适应特性有着明显差异。美洲斑潜蝇适应的温度范围较广,相对较高的温度有利于种群的发育、生存及繁殖;而南美斑潜蝇适应的温度范围相对较窄,且适温范围明显偏低,高温不利于种群的增长;在各自的适温条件下,两种斑潜蝇都有很强的种群增殖能力。     

美洲斑潜蝇发生的物候学模型

对美洲斑潜蝇各虫态发育与温度的关系的系统了解是利用寄生蜂防治斑潜蝇的关键。以花斑芸豆(Phaseolusvulgaris L.)为寄主 ,在 1 3、1 6、1 9、2 2、2 5、2 8、31、34℃ ,± 0 .5℃等温度下确定了美洲斑潜蝇的发育起点温度和有效积温。以 9.5℃为起点温度 ,建立了描述各虫态进程的物候学随机模型。结果表明 :各虫态占 50 %的种群数量时的有效积温量分别为 ,卵 46.97日度 ,幼虫 1 0 6.97日度 ,蛹 2 53.58日度。幼虫高峰期的积温为 75日度左右。化蛹积温在 90～ 1 2 0日度之间。成虫在 2 0 0日度开始羽化 ,30 0日度时全部个体基本羽化完成。蛹期的积温量与卵和幼虫的积温量之和相近。该模型能够很好地描述温室中变温条件下的美洲斑潜蝇种群动态过程 ,更有利于开展寄生蜂与美洲斑潜蝇之间关系的研究。     

温度对美洲斑潜蝇及南美斑潜蝇种群增长的影响

在恒温条件下观察了美洲斑潜蝇和南美斑潜蝇实验种群的发育、存活及繁殖情况,拟合了两种斑潜蝇发育速率与温度之间的关系模型,求出了各发育阶段的发育起点温度及有效积温,组建了不同温度下两种斑潜蝇实验种群的生殖力表,计算了主要的生命表参数.结果表明,温度对两种斑潜蝇的发育、存活、繁殖均有显著的影响,且两种斑潜蝇对温度的适应特性有着明显差异.美洲斑潜蝇适应的温度范围较广,相对较高的温度有利于种群的发育、生存及繁殖;而南美斑潜蝇适应的温度范围相对较窄,且适温范围明显偏低,高温不利于种群的增长;在各自的适温条件下,两种斑潜蝇都有很强的种群增殖能力.     

两种外来斑潜蝇实验种群生物学特征比较

美洲斑潜蝇LiriomyzasativaeBlanchard和南美斑潜蝇Liriomyzahuidobrensis(Blanchard)是我国的2种重要入侵性害虫。本实验室在标准化流程下饲养了48(L.huidobrensis)-160(L.sativae)个世代的稳定实验种群。美洲斑潜蝇的实验种群需要较大的繁殖规模(>100对)才能保持群体的稳定性。2种斑潜蝇4个发育阶段的形态特征和幼虫为害特征差别明显。南美斑潜蝇的发育历期比美洲斑潜蝇长,总产卵量低于美洲斑潜蝇,但产卵历期明显长于美洲斑潜蝇。这可能是南美斑潜蝇较之容易繁殖的重要原因。该实验种群的建立为物种驯化、寄主选择性、抗性筛选及其它生理学、生态学等诸多研究打下基础。     

南美斑潜蝇蛹期的生物学特性

南美斑潜蝇Liriomyzahuidobrensis在 1 5 ,2 0 ,2 5 ,30 ,35℃时 ,其蛹的历期分别为 34 5 ,1 5 8,1 0 1 ,7 2d ,而在 35℃时则不能正常羽化。土壤相对含水量为 30 %～ 90 %均比较适合南美斑潜蝇蛹的发育 ,就死亡率而言 ,它们之间没有显著差异。浸水处理表明 ,南美斑潜蝇的预蛹及蛹的初期和末期对浸水比较敏感 ,死亡率均达到 90 %以上 ,而处于中间期的蛹对浸水相对不敏感。田间调查和室内饲养均发现 ,南美斑潜蝇在 1 2时以前的化蛹个数占 1d总化蛹个数的 90 %以上 ,而 1 4时以前的羽化数占 1d总羽化数的 99%以上。南美斑潜蝇化蛹的场所在不同时期不同的蔬菜上有所不同 ,越冬时主要是以蛹在越冬寄主田的土壤中越冬 ,在生长季节 ,除了在菜豆的叶片反面化蛹外 ,其它蔬菜上则是在土壤和下部叶鞘上化蛹。     

江苏地区三叶斑潜蝇和美洲斑潜蝇的发生危害及种群动态

【目的】三叶斑潜蝇Liriomyza trifolii和美洲斑潜蝇Liriomyza sativae是一类危害蔬菜、花卉的世界性害虫,也是我国重要的外来入侵害虫。了解其发生危害特征,可为这两种斑潜蝇的防治提供科学依据。【方法】于2015年对江苏地区的两种斑潜蝇的发生分布、危害程度以及在扬州地区的发生动态进行了调查,采集含有潜道的叶片,待蛹羽化为成虫后鉴定斑潜蝇种类,同时统计叶片上的潜道数量划分危害等级。【结果】美洲斑潜蝇主要在苏北地区发生危害,三叶斑潜蝇主要在苏南、苏中地区发生危害;两种斑潜蝇在江苏地区的发生危害程度均未超过3级。在扬州地区的蔬菜上仅调查到三叶斑潜蝇的危害,其危害的寄主植物有6科、12种,主要包括茄科、豆科、葫芦科、十字花科的蔬菜。三叶斑潜蝇的发生危害从3月开始,11月结束,全年有3个发生危害高峰,其中在7月下旬至8月初的发生危害最重。【结论】两种斑潜蝇在江苏地区的种类分布呈现出明显的地理差异,同时扬州地区三叶斑潜蝇的虫口密度随寄主和时间不同呈现的明显,因此生产上需加强对斑潜蝇发生危害进行监测,并指导斑潜蝇防治。     

Molecular identification of Liriomyza trifolii (Burgess) (Dipt., Agromyzidae) based on real-time PCR

Abstract:  Rapidly identifying juvenile individuals of Liriomyza trifolii (Burgess) from Liriomyza sativae Blanchard is crucial in plant quarantine. We report a molecular method to identify L . trifolii based on real-time polymerase chain reaction (PCR). By comparing partial DNA sequences of mitochondrial COI genes of L . trifolii samples collected from Guangdong and Taiwan provinces in China, Japan, Philippine, Israel, Germany, the USA, Mexico and Honduras sequenced by authors, and those of related species recorded in GenBank, a L . trifolii -specific probe was developed. There was no difference in individuals of different stages tested by this probe. The total time for real-time PCR assay system was 2 h, and it would save 3–7 h compared with conventional PCR.     

三叶斑潜蝇发生特点研究

2007—2009年在浙江杭州对三叶斑潜蝇的发生情况进行了调查。结果表明,在杭州地区范围内该虫的分布已很广,与其他斑潜蝇混合发生。春夏季以美洲斑潜蝇为害为主,6月是为害盛期。秋冬季为多种斑潜蝇混合为害,9月是混发盛期,期间以三叶斑潜蝇为害占多数。目前查到有13种寄主作物受三叶斑潜蝇为害。     

美洲斑潜蝇及其寄生性天敌的生态位

通过调查美洲斑潜蝇及其主要寄生性天敌冈崎姬小蜂Neochrysoclaris okazakii Kamijo,芙新姬小蜂Neochrysoclaris formosa Westood和攀金姬小蜂Chrysocharis petheus Walker的时间和空间生态位,测定出生态位宽度,重叠和比例相似性,在生态位测定的基础上,按生态位的理论观点,探讨了寄生性天敌在美洲斑潜蝇综合治理中的控制作用。     

美洲斑潜蝇空间分布型研究

通过采用聚集度指标的方法,对美洲斑潜蝇在黄瓜田空间分布型进行了系统的研究。测定结果属均匀分布,为田间调查及防治提供了依据。     

Primer design for identifying economically important Liriomyza species (Diptera: Agromyzidae) by multiplex PCR

Leafminer flies, especially, Liriomyza huidobrensis, Liriomyza sativae and Liriomyza trifolii, are quarantine species in many countries. Their morphological similarity makes identification difficult. To develop a rapid, reliable, sensitive and simple molecular identification method using multiplex PCR, we newly sequenced the mitochondrial cytochrome oxidase I (COI) genes of Liriomyza bryoniae, Liriomyza chinensis, L. huidobrensis, L. sativae, L. trifolii, Chromatomyia horticola and four parasitoid species. We aligned them with all the COI sequences of the leafminer flies found in the international DNA nucleotide sequence databases (DDBJ/EMBL/GenBank). We then designed species‐specific primers to allow us to differentiate between L. bryoniae, L. chinensis, L. huidobrensis, L. sativae, and L. trifolii.     

南美斑潜蝇在山东发生危害的特点观察

通过室内饲养及田间调查了解南美斑潜蝇的发生危害特点。结果表明 ,雌虫并非一定将卵产在取食孔内 ;当粗潜道形成时 ,潜道数和幼虫数不一致 ;幼虫在不同寄主植物上取食危害的症状不同 ,其化蛹部位也不同。