不同时间采集的小牛血清对CHO-C28细胞培养及表达的影响

通过研究小牛血清对CHO-C28细胞培养及HBsAg表达的影响,探讨小牛血清的不同采集时间对血清质量的影响。采集出生后4、8、12h(未进食)小牛的血清,对CHO-C28细胞进行传代、换液培养,并检测乙肝表面抗原(HBsAg)表达量。结果可见:①在细胞传代4次时,4h采集的血清细胞生长状态良好,8h采集的血清细胞出现明显的衰老,12h采集的血清细胞大面积死亡;②在细胞维持换液方面,4h采集的血清可维持细胞换液25次以上,8h采集的血清可勉强维持20次,12h采集的血清维持细胞换液10次时已大部分死亡;③乙肝表面抗原(HBsAg)表达量的检测结果,同批培养上清,4h采集的血清培养细胞表达量最高。可见,小牛出生后采集血清时间越早越好。     

几种乙型肝炎病毒DNA重组质粒的改建及其在哺乳动物细胞高效表达乙型肝炎表面抗原

将Bgl Ⅱ不完全水解pTHBV一1质粒产生的两种乙型肝炎病毒(HBV)DNA片段插入pSV2-dhft质粒的Bglll切口,构造成{种重组质粒,其结构特点是：1都含有SV40的DNA复制起点和早期启动子;2都含有二氢叶酸还原酶基因(dhfr) 3·{种重组质粒是在dhfr。基因3’末端分别插入两种大小不同,方向相反的HBV’DNA片段而成。使用这4种质粒DNA分别和tk质粒DNA共转化Ltr细胞,在HAT培养基选择压力下4种质粒都得到有效表达HBsAg。通过换用氨甲喋呤并逐渐增加其药量,从氨甲喋呤抗性细胞中获得高效表达HBsAg的B2和B16细胞系。据固相放射免疫检测结果计算,B16细胞系的HBxAF分泌量可达12．5pg／10’细胞／天．细胞传代4个月表达稳定。这些细胞在HBsAg诊断试剂和疫苗研制中具有潜在的应用价值。     

抗乙型肝炎病毒表面抗原“y”亚型及“a”组抗原决定簇杂交瘤细胞株的建立与应用

用部分纯化的HBsAg/adr和ayw亚型免疫Balb/c小鼠的脾细胞,在PEG作用下与Sp2/o骨髓瘤细胞进行融合,经ELISA及RIA法筛选出了分泌抗HBsAg/a(SH 1 D9)、抗HBsAg/y(SG 3 B10)亚型决定簇的杂交瘤细胞系,在组织培养上清液中它们的滴度分别     

生物反应器规模化培养重组CHO-C28细胞表达HBsAg的研究

应用新型聚酯纤维盘片,采用连续灌注培养方式,分别试验了细胞接种量、pH、DO、罐流速度等因素对CHO-C28细胞生长分泌HBsAg的影响,初步建立了5L生物反应器生产重组乙型肝炎疫苗的生产工艺。经3次试验培养,每次培养60d,较适宜的培养条件确定为:pH6.80-7.10,DO 20%-30%,温度36-37℃,灌流速度138ml/h,接种浓度1.9×106cell/ml。收获液的HBsAg平均滴度是1∶256,最高滴度可达1∶512,纯化后的HBsAg产率为0.912mg/L。最后对反应器培养工艺与现行的转瓶培养工艺进行了比较,生物反应器培养具有可控制培养条件、不易污染和可使HBsAg产率提高等优点。     

B7-2小鼠胚胎癌细胞的无血清培养

本文报道以RPMI-1640,DMEM和HAM/F 12人工培养基做基础培液,加入牛血清白蛋白、胰岛素和转铁蛋白等物质,发展了一种无血清(B7-85)培液。在B7-85液中,B7—2EC细胞生长速率虽略低于含10％小牛血清常规培液,但细胞形态、生长行为和在同系宿主体内的长瘤率及分化潜能,均未发现存在区别。因此,B7-85液是适于B7-2EC细胞生长的无血清人工培液。这种人工培液中除胰岛素外,没有人为地增添外源性多肽生长因子,这将有利于分析B7-2EC细胞和其分化细胞产生的内源性生长因子。     

乙型肝炎病毒表面抗原基因在中国地鼠卵巢细胞中的高效表达及纯化抗原免疫原性的研究

本文报告了两个拷贝的adr亚型HBs基因的pSV2质粒组建,其中一个拷贝只含S基因,受SV40早期启动子的直接控制,另一个拷贝连接于pSV2质粒dhfr基因下游,含有前S和S基因及其本身的启动子,用此重组质粒转化CHO-dhfr~-细胞,经选择,获得了高效表达HBsAg的CHO-32-C23及CHO-Ⅱ-5细胞系,最佳培养条件及HBsAg分泌动态的研究结果表明,CHO-Ⅱ-5系细胞分泌HBsAg的最佳条件是37℃培养,培养基中加2％小牛血清,每日收换液;用5％小牛血清,每48小时收换液则次之,但较实用,转瓶培养产量约2.μg/ml,将CHO-32-C23细胞系产生的液体初步纯化,在聚丙烯酰胺凝胶上显示23k和27k蛋白带,用其免疫NIH小鼠,EDSO为0.119μg,对照血源菌ED_(50)为0.083μg,二者的免疫原性近似。     

应用生物反应器连续培养基因重组CHO细胞的研究

应用5L生物反应器悬浮培养乙肝重组DNA转化的CHO细胞B43株生产HBsAg。试验了细胞接种量、微载体的加入方式、培养方法(半流加培养和连续灌流名养)对细胞生长形态和HBsAg分泌的影响,初步建立了5L生物反应器的生产工艺,在5L生物反应器最适合连续灌流培养的条件是pH 7．30—7．40,Do 25～3;％,T 36．5℃,微载体6～8g／L,灌流速度5．5—7．5L,24h细胞连续培养60天,细胞密度维持在5．O×10　6～1．O×10　7／ml之间,收获细胞液的RPHA效价为l：512—1：1024．HlBsAg含量为3－5mg／I。     

人EPO高效表达细胞株的筛选与鉴定

用氨甲喋呤 (MTX)对稳定转染人促红细胞生成素 (EPO)基因的CHOˉ(DHFR缺陷型 )细胞株进行梯度加压 ,并使用α -MEM培养基进行培养 ,使DHFR基因在CHOˉ细胞中大量扩增 ,从而使EPO的表达量提高。经检测分析EPO的表达量 ,筛选出EPO高效表达的细胞株。结果表明 ,用MTX加压到 16× 10 - 7mol l和 6 4× 10 - 7mol l浓度时 ,收集的细胞培养液经 (NH4 ) 2 SO4 盐析、透析等处理得到EPO抽提液 ,经SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS -PAGE)检测出与标准品相对应的一条带 ,WesternBlot证明该带确为EPO。     

乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白基因在中国地鼠卵巢细胞中的高效表达及其产物活性的初步检测

构建了pSV2DHWS2S质粒,使dhfr扩增基因及乙型肝炎病毒的Pre-S_2+S基因分别在两个SV40早期启动子的调控之下。此质粒转化到CHO-dhfr~-细胞,经克隆、加氨甲喋呤(MTX)筛选、扩增,建立了3个高效分泌HBsAg中蛋白及主蛋白的克隆细胞系。检测了其中的M6细胞系生物学特性。结果表明,免疫电镜下可观察到22nm的颗粒;该细胞用转瓶连续培养60天,每2天收、换液1次,每升HBsAg平均产量为2.9mg。经初步纯化,在SDS-PAGE中显示23k、27k主蛋白带及33k、36k中蛋白带。主蛋白及中蛋白的反相血凝(RPHA)滴度分别为64和128;中蛋白的ELISA滴度为320。部分品系小鼠免疫后能产生滴度为8的抗Pre-S_2抗体。3只家免中仅有1只在免疫后第1、2周可测出Pre-S_2抗体,而3只兔的S抗体滴度都较高,持续时间也较长。     

Cd胁迫下枯草芽孢杆菌B12产表面活性素及其对生物被膜形成和Cd去除的影响

【背景】枯草芽孢杆菌可通过群集的方式形成生物被膜,而生物被膜在去除重金属方面发挥着重要作用。【目的】探究枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) B12缓解Cd (CdSO4)胁迫的机制。【方法】考察Cd胁迫对B12生物被膜形成的影响,用酸沉淀法、反相高效液相色谱和液质联用分析(LC-MS)对有无Cd胁迫条件下菌株B12分泌的脂肽化合物进行提取、纯化和主要成分鉴定,并探究该主要成分对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) B12、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti) Mr40、解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens) P29生物被膜形成和吸附Cd的影响。【结果】在含Cd浓度为0-1.0 mg/L的Msgg培养基中,B. subtilis B12生物被膜干重显著增加。Cd胁迫促进菌株B12分泌脂肽化合物,其中表面活性素(Surfactin)含量增加。在含Cd浓度为0.5mg/L的Msgg培养基中添加Surfactin后,菌株B12、Mr40、P29生物被膜干重比未添加时显著增加84.1%-126.9%,浮游细胞数量显著下降46.9%-55.3%,3株菌株对Cd去除率显著增加23.0%-36.1%,浮游细胞吸附Cd比例显著下降,生物被膜吸附Cd比例显著增加了46.8%-68.1%。【结论】Cd胁迫下菌株B12通过分泌更多的Surfactin来调控自身以及其他菌株生物被膜的形成来吸附更多的Cd,从而缓解Cd胁迫。     

SPHINGOLIPIDS AND PHOSPHOLIPIDS IN MICROSOMES AND MYELIN FROM NORMAL AND PATHOLOGICAL BRAINS

—Myelin and microsomes were separated from human cerebral white matter and cortex respectively using the technique of 15% caesium chloride and their sphingolipid and phospholipid contents estimated. Normal brains as well as cerebral material from cases of metachromatic leucodystrophy, Krabbe's disease and Tay-Sachs’disease were studied. Gangliosides were not present in normal myelin but were found in microsomes and in myelin from the pathological material. The ratio of cerebroside to sulphatide in myelin was 4 to 1 in normal, 1 to 20 in metachromatic and 7 to 1 in Krabbe's disease. The results in the human material are briefly discussed.     

HIGH AND LOW DENSITY WATER AND RESTING,ACTIVE AND TRANSFORMED CELLS

Resting and active states of cells are described in terms of the expectation, derived from experiments with aqueous polymers, that they contain two modified forms of water: high density, reactive, fluid water and low density, inert, viscous water. Low density water predominates in a resting cell and is converted to high density water in an active cell. It is proposed that switching from one state to another is an integral part of cellular function. When this ability is lost cells are transformed either to a state of rigor or to a hyperactive state in which they no longer depend upon external signals.