聚乙二醇定点修饰重组人粒细胞集落刺激因子突变体的研究

研究了重组人粒细胞集落刺激因子突变体（rmhG-CSF）的聚乙二醇化修饰、分离纯化和活性鉴定。通过对人重组粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）第1,3,4,5,17位氨基酸进行突变,并在C末端加了一个半胱氨酸,获得了体外活性为原型rhG-CSF 150％以上的重组人粒细胞集落刺激因子突变体（rmhG-CSF）。然后用分子量为20kD的甲氧聚乙二醇马来酸酐（mPEG-Mal）修饰rmhG-CSF,反应混合物经离子交换和凝胶过滤柱纯化,得到纯化的聚乙二醇重组人粒细胞集落刺激因子突变体（PEG-rmhG-CSF）。SDS-PAGE电泳分析表明纯化后的PEG-rmhG-CSF的纯度大于95％,体外活性分析表明PEG-rmhG-CSF活性优于目前临床使用的聚乙二醇重组人粒细胞集落刺激因子（PEG-rhG-CSF,Neulasta^?）,药代动力学研究表明PEG-rmhG-CSF体内半衰期约为14h,比修饰前延长了7倍。     

聚乙二醇单修饰重组人粒细胞集落刺激因子的研究

制备单修饰的PEG蛋白偶联物,对获得重复性好的修饰产品,减少后续分离步骤具有重要的意义。用N-羟基琥珀酰亚胺活化法对单甲氧基聚乙二醇 (mPEG,分子量20000) 进行活化,红外光谱分析, 并考察了其水解动力学性质。对重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)进行化学修饰,通过正交试验结合SDS-PAGE电泳检测建立了单条PEG链修饰rhG-CSF的条件,单修饰PEG-rhG-CSF的收率为90%。离子交换层析对修饰产物进行分离纯化,高效凝胶过滤色谱(SEC-HPLC)检测纯度达到97%。     

重组人粒细胞集落刺激因子的纯化

重组人粒细胞集落刺激因子（ｒｈＧ－ＣＳＦ）在工程菌ｐＣＧ－１／ｒｈＧ－ＣＳＦ／ＤＨ５ａ中以无活性的包涵体形式大量表达。经过菌体破碎分离包涵体、包涵体变性复性后,ｒｈＧ－ＣＳＦ的活性得到恢复。用离子交换和疏水层析纯化了ｒｈＧ－ＣＳＦ,比活性达１．５７×１０８ｕ／ｍｇ,纯度大于９８％。     

聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子的药效学研究

比较研究聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子(PEG-rhG-CSF)与重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)升高环磷酰胺所致外周血白细胞降低的Blab/c小鼠的白细胞效果.结果显示一次注射聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子与多次注射重组人粒细胞集落刺激因子的药效作用相当,且各剂量间呈良好的量效关系.     

两步连续离子交换制备色谱分离纯化聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子

建立了两步连续离子交换制备色谱分离、纯化聚乙二醇与重组人粒细胞集落刺激因子 (Recombinanthumangranulocytestimulatingfactor,rhG_CSF)偶联物的方法。首先用阳离子交换色谱将偶联蛋白质和非偶联蛋白质分开 ,然后使用阴离子交换色谱去除过量的游离聚乙二醇杂质 ,并分离纯化偶联蛋白异构体分别得到单聚乙二醇化、双聚乙二醇化和三聚乙二醇化的rhG-CSF。它们经十二烷基磺酸钠_聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)分析均为单带。采用基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱(MALDI-TOF)分析三种偶联蛋白质的分子量 ,分别为 23.8kD、28.6kD、33.8kD。用噻唑蓝 (MTT)比色法 ,以粒细胞集落刺激因子的依赖细胞株NFS_6 0为靶细胞 ,测定重组人粒细胞集落刺激因子及其与聚乙二醇的偶联物的体外细胞生物学活性 ,单聚乙二醇化、双聚乙二醇化和三聚乙二醇化的rhG_CSF体外活性保留率分别为 92 %、75 %、4 3%。     

重组人粒细胞集落刺激因子的N端氨基定点PEG化修饰

尽管重组粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)具有重大的治疗价值,然而在实际应用却受到体内半衰期过短因而需要频繁重复注射的限制．为了解决这一问题,我们利用两种不同分子量（5 kD和 20 kD）的单甲氧基聚乙二醇丙醛（mPEG-PAL）对rhG-CSF的N端氨基进行了定点PEG化修饰．通过正交实验的统计学方法得到了最适修饰条件．研究发现,PEG化后的rhG-CSF具有了更高的体外稳定性,其体内活性也得到了很大提高,体内作用时间得到很大延长．因此,对于rhG-CSF的N端氨基定点PEG化修饰,可以显著提高rhG-CSF的临床应用价值．     

重组人粒细胞集落刺激因子的复性研究

通过小试研究对重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)的复性条件,如氧化剂和还原剂比例、操作方法、时间和蛋白浓度,进行了优化选择,并在此基础上进行了中试放大试验的验证.试验结果表明,采用优化后的复性方法复性液中rhG-CSF的效价可达到1.8×107U/ml以上,比活性达到0.9×108/mg以上.     

重组人粒细胞集落刺激因子发酵工艺研究

通过对大肠杆菌（E.coli）表达重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）工程菌DH5a的发酵工艺的研究,对影响工程菌生长和目标蛋白表达条件如：发酵培养基配方,pH值,诱导时间,分批补加营养物质等进行了优化。结果表明,采用优化的条件发酵后,工程菌得率达30g/L以上;目标蛋白表达量为30%以上。     

大肠杆菌表达的重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的纯化

对重组人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ｒｈＧＭ－ＣＳＦ）高效表达克隆ｐＺＷ．ＧＭ的表达产物进行了纯化,并对纯化的ＧＭ－ＣＳＦ进行了Ｎ端氨基酸序列分析。人ＧＭ－ＣＳＦ基因表达产物在大肠杆菌中以不溶性包涵体形式存在,经过超声破菌、包涵体抽提、凝胶过滤层析、复性、离子交换一系列化步骤,终产物纯度达９９％,按蛋白总量计算回收率达１０％,比活性达１×１０＾７ｕ／ｍｇ蛋白质。通过测定纯化人ＧＭ－ＣＳＦ的Ｎ端１     

重组人粒细胞集落刺激因子的表达、纯化以及PEG修饰

重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)经大肠杆菌温度诱导表达后,其表达产物以包涵体形式存在,包涵体经过变性、复性和分离纯化等步骤处理后得到纯化的rhG-CSF.在一定的实验条件下用单甲氧基聚乙二醇活性酯(mPEG20k-NHS)对rhG-CSF进行化学修饰,所得修饰产物经分离纯化后获得PEG20K-rhG-CSF偶联物.与修饰前的rhG-CSF相比较,尽管修饰后的rhG-CSF体外生物学活性下降至修饰前的20%左右,但其在体内的作用时间能够得到显著的延长,药效有了明显提高.     

用疏水色谱法复性并同时纯化重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子

目的：建立一种简单、快速复性并同时纯化大肠杆菌表达的重组人粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）的方法。方法：研究rhGM-CSF在疏水色谱（HIC）上的复性和纯化机理,并对固定相和流动相进行选择和优化,包括固定相配基、流动相中盐的种类、流动相pH值、流动相中还原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）的比例,以及流动相中尿素的浓度。结果：优化后的固定相为PEG600,流动相中的盐为（NH4）2SO4,流动相pH值为7．0,流动相中添加2．0mol／L尿素、1．8mmol／LGSH和0-3mmol／LGSSG。在优化条件下,HIC可使rhGM-CSF在分离纯化的同时得到复性,比活达1．58×10^7U／mg,纯度为95．7％,质量回收率为56．8％。结论：建立的疏水色谱复性和纯化工艺可简化操作步骤,缩短生产周期。     

聚乙二醇重组人粒细胞刺激因子Ib期临床NSCLC人体试验的安全性研究

目的:考察非小细胞肺癌患者化疗后对HHPG-19K的耐受性及该药物的安全性.方法:随机将招募受试者30例平均分成设五个试验组:HHPG-19K 3个剂量组(60 μg/Kg、100 μg/Kg、200 μg/Kg)、阳性对照组(惠尔血,即G-CSF 5 μg/Kg/天)和阴性对照组,对比5组的安全性观察指标.结果:3个剂量组均出现不良事件,占总人数的100％;另外,实验室检查值的异常主要有ALP、ALT及AST升高等.不良事件的类型和严重程度均为轻中度,与阳性对照组无差异(P＜0.05).而阴性对照组发生不良事件为13％,少于剂量组与阳性对照组(P＜0.05).结论:试验用药物HHPG-19K在非小细胞肺癌化疗患者中具有较好的耐受性,且不产生耐药性抗体,其中100 μg/kg安全性更好.     

rhGM-CSF联合氨磷汀治疗放射性口腔黏膜炎的临床疗效及对外周血淋巴细胞亚群的影响

摘要 目的：研究重组人粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）联合氨磷汀治疗放射性口腔黏膜炎患者的临床治疗疗效以及对外周血淋巴细胞亚群的影响。方法：选取2019年1月到2020年12月在我院接收治疗的放射性口腔黏膜炎患者60例,随机分为对照组和rhGM-CSF组两组,每组30例。对照组接受静脉滴注氨磷汀治疗,rhGM-CSF组接受rhGM-CSF漱口液漱口联合静脉滴注氨磷汀治疗。比较两组患者临床治疗疗效、治疗后口腔黏膜炎评分、疼痛评分、吞咽功能、血清炎症因子以及外周血淋巴细胞亚型。结果：（1）rhGM-CSF组患者临床治愈率和治疗总有效率分别为26.67 %和90.00 %,均高于对照组6.67 %临床治愈率和70.00 %临床治疗总有效率（P<0.05）。（2）治疗后,rhGM-CSF组口腔黏膜炎评分、疼痛评分、吞咽功能、血清干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子（TNF-α）和白介素-6（IL-6）含量均显著低于对照组患者（P<0.05）。（3）rhGM-CSF组患者治疗后外周血CD3⁺T淋巴细胞与对照组比较无差异（P>0.05）,外周血CD4⁺和CD4⁺/CD8⁺T淋巴细胞亚群显著高于对照组患者,而CD8⁺T淋巴细胞亚群显著低于对照组患者（P<0.05）。结论：rhGM-CSF漱口液联合静脉滴注氨磷汀治疗治疗放射性口腔黏膜炎临床疗效更优,有助于减轻患者外周血炎症反应,增强细胞免疫功能。     

聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子及其药品通用名称命名

有越来越多的聚乙二醇修饰人粒细胞刺激因子研发上市。为适应这类制品的发展,中国药品通用名命名原则也需要不断更新修订。简要介绍了聚乙二醇修饰蛋白技术以及WHO国际非专利药品名(INN)命名委员会对这类制品的命名情况,讨论了我国对这类制品的药品通用命名原则和方法,建议对聚乙二醇化不同的修饰形式在名称上适当加以区分,并注意加强与INN命名委员会的交流合作。     

重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子包涵体提取、复性和纯化的研究

由基因工程大肠杆菌表达的重组人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ｒｈＧＭ－ＣＳＦ）以包涵体的形式存在于细胞中,通过破菌、洗涤获得包涵体,再经过溶解、凝胶过滤、复性、疏水和离子交换柱导析得到了均一的产品,经高压液相和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳测定纯度均大于９８％,ｒｈＧＭ－ＣＳＦ的比活为３．２×１０＾７ＩＵ／ｍｇ,纯化获得的ｒｈＧＭ－ＣＳＦ为一酸性蛋白,等电点约为５．２,ＮＨ２－末端有２０个氨基酸序列测定结果     

人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子研究进展

hGM-CSF是一种重要的具有免疫调节功能的糖蛋白,在造血调控和免疫调节方面发挥重要作用,具有重要的临床应用价值。总结近些年来各国对hGM-CSF的研究情况,首先对hGM-CSF的基因结构、蛋白分子结构、生物学活性等方面做了详细的介绍;接下来,又从基因转录水平和转录后水平两个方面对hGM-CSF的表达调控做了介绍;最后,对比了利用基因工程技术将hGM-CSF基因在不同生物中的表达情况,详细讲解了优缺点。     

何氏生髓方联合聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子防治肺腺癌患者化疗后骨髓抑制的临床效果研究

摘要 目的：探讨何氏生髓方联合聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子（PEG-rhG-CSF）防治肺腺癌患者化疗后骨髓抑制的临床效果。方法：选取广州中医药大学东莞医院2021年3月~2022年10月期间收治的100例肺腺癌患者作为研究对象,采用随机数字表法将患者分为对照组（n=50,PEG-rhG-CSF治疗）和观察组（n=50,何氏生髓方联合PEG-rhG-CSF治疗）。观察两组中医证候积分、T淋巴细胞亚群指标、外周血象和中性粒细胞减少发生率变化情况。结果：治疗4个周期后,观察组神疲乏力、胃纳差、食少纳差、少气懒言、自汗盗汗、腰膝酸软症状评分低于对照组（P<0.05）。治疗4个周期后,观察组CD3⁺、CD4⁺、CD4⁺/CD8⁺高于对照组;CD8⁺低于对照组（P<0.05）。治疗4个周期后,观察组白细胞计数（WBC）、血小板计数（PLT）、中性粒细胞计数（NEUT）、血红蛋白（Hb）高于对照组（P<0.05）。观察组中性粒细胞减少发生率低于对照组（P<0.05）。结论：何氏生髓方联合PEG-rhG-CSF防治肺腺癌患者化疗后骨髓抑制,可提高机体免疫力,改善临床症状和外周血象,降低中性粒细胞减少发生率。