几丁寡糖,壳寡糖的应用与开发

几丁寡糖、壳寡糖的应用与开发大连理工大学化工学院１１６０１２黄丽萍刘宗明甲壳质是Ｎ—乙酰基—Ｄ—葡萄糖胺以β—１,４键结合而成的多糖,它是作为蟹、虾等甲壳类、甲虫等的外骨骼及蘑菇等菌类的细胞壁构成成分,广泛存在于自然界的天然高分子物质。它的脱Ｎ—乙酰...     

橄榄绿链霉菌细胞膜中几丁单、寡糖结合蛋白质的分离、纯化和结合动力学

橄榄绿链霉菌细胞膜中存在能与N 乙酰葡糖胺特异性结合的蛋白质。采用超声波破碎、超速离心等方法 ,分离得到细胞膜后用TritonX 10 0抽提 ,经连续的阴离子层析后 ,可分别得到能与N 乙酰葡糖胺特异性结合的 46 .0kD和 47.5kD蛋白质。底物竞争结合实验证实 ,这两种蛋白质还能与其他几丁质降解产物 (几丁二糖至几丁六糖 )特异性结合而不与葡萄糖、纤维二糖等结合。采用介质表面感应技术 (surfaceplasmonresonance)检测出46kD蛋白质与几丁单糖至几丁六糖的解离常数 (Kd)在 8.2 9× 10 -9～ 1.95× 10 -5mol/L之间 ,单糖最高而三糖最低。决定其差异的主要因子是底物结合速率 (Kon)而非解离速率 (Koff)。N末端氨基酸序列分析结果推测 ,该蛋白质属于一个潜在的ATP结合转运系统     

一种几丁质酶基因的克隆表达及酶解产物分析

【目的】克隆耐冷菌假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.DL-6)的几丁质酶基因并进行原核表达,纯化重组蛋白并研究其酶解产物。【方法】采用PCR扩增法从Pseudoalteromonas sp.DL-6中克隆几丁质酶基因(chi A),连接到表达载体p ET28a,导入Escherichia coli BL21(DE3)进行诱导表达。SDS-PAGE检测几丁质酶Chi A的分子量与纯度,4-甲基伞形酮荧光底物4MU-(Glc NAc)2测定酶活,电喷雾质谱(ESI-MS)检测酶解产物。【结果】chi A基因(Gen Bank登录号KF234015)在大肠杆菌中高效表达,Ni-NTA亲和层析柱纯化几丁质酶Chi A的总活力可达168.68 U。ESI-MS检测结果表明重组蛋白酶解1%胶体几丁质的产物为几丁寡糖。【结论】利用内切几丁质酶Chi A水解几丁质生产几丁寡糖,为其在食品、医药和农业等领域的潜在应用提供有利参考。     

几丁寡糖对脂肪酸代谢紊乱的抑制作用及分子机制

旨在从细胞学实验及整体动物水平探讨几丁寡糖(NACOS)对机体脂代谢紊乱的抑制作用及其潜在的分子机制。在细胞学实验中,HepG2细胞被分为4组,即对照组、棕榈酸(Palmitic acid,PA)组、几丁寡糖(NACOS)组、NACOS+PA组。在体内实验中,将雄性C57BL/6小鼠随机分为4组(n=5),即正常对照(NCD)组、高脂饮食(HFD)组、NACOS组、NACOS+HFD组,实验共20周。主要检测方法如下:采用油红O染色检测细胞脂质沉积,RT-PCR方法检测脂代谢调控分子及炎症因子的转录表达水平,Western blotting方法检测MAPKs及PI3K/Akt通路中相关蛋白激酶的蛋白磷酸化水平。细胞学实验表明,NACOS对HepG2没有明显的细胞毒性作用,并能显著降低细胞内脂滴颗粒的沉积,下调肝细胞及小鼠肝脏组织中脂代谢相关调控因子(PGC1α、Cox5b及Mcad)及炎症因子IL-1β的转录表达水平(P0.05或0.01),抑制肝细胞及肝脏组织中p38、ERK1/2及Akt蛋白激酶的激活(P0.05或0.01)。基于上述研究,NACOS可抑制肝脏线粒体脂肪酸氧化和脂质从头合成途径,阻断炎症反应的发生,从而预防脂代谢紊乱的发生。     

甲壳素酶Chisb的定向进化及生物转化合成几丁寡糖

甲壳素酶具有广泛的工业应用前景,如可将虾壳、蟹壳和其他甲壳废物降解成以几丁寡糖为主的高附加值产品,但野生型甲壳素酶催化效率低,大大限制了几丁寡糖的生产。笔者在前期研究中表达了一个具有较高效催化效率的甲壳素酶Chisb,并对其酶学性质进行了初步研究。为进一步提高甲壳素酶Chisb的催化效率,以R13NprB-C-SP-H为亲本,采用易错PCR(Error-pronePCR)技术构建随机突变体文库,对甲壳素酶Chisb进行定向进化。经过96孔板初筛和摇瓶复筛,获得了两个催化效率进一步提高的突变体C43D和E336R。对突变体的酶学性质进行分析, C43D和E336R的最适催化温度为55℃, C43D的最适pH为5.0,E336R的最适pH为9.0;其催化效率相比对照分别提高了1.35倍和1.57倍;而E336R和C43D催化产几丁寡糖的含量分别为2.53 g/L和2.06 g/L,相比对照(0.89 g/L)分别提高了2.84倍和2.31倍;底物转化率分别为84.3%和68.7%,相比对照(29.7%)分别提高了54.6%和39%。研究表明,通过易错PCR引入随机突变的方法能够有效提高甲壳素酶Chisb的催化效率。上述研究获得的催化效率提高的正向突变体及其酶学性质分析对生物转化合成几丁寡糖具有重要研究意义和应用价值。     

植物Ⅴ类几丁酶苦瓜同源基因(McChi5)的克隆及特征分析

苦瓜是一种病害很少的蔬菜作物.用3′RACE方法从苦瓜叶片RNA中扩增了一个与烟草Ⅴ类几丁酶序列相似的片段,进一步用Y-RACE方法扩增了相应的5′端序列.经序列拼接,获得了植物Ⅴ类几丁酶苦瓜同源基因(McChi5)的全长cDNA基因.该基因全长1348bp,含有一个1044bp的ORF.推测的蛋白质由347个氨基酸组成,计算所得的分子量为38.3kD,等电点为5.77.同源性分析表明,McChi5蛋白与烟草V类几丁酶、拟南芥的推测几丁酶和类几丁酶蛋白、以及哺乳动物和细菌的一些几丁酶有序列相似性,并具有第18家族糖基水解酶的保守域.Southern blotting表明,在苦瓜基因组中存在2个拷贝的McChi5基因,同时也存在少数同源基因.RNA dot blotting分析表明,McChi5基因有组成性表达的特性,伤害处理对其表达的影响不明显.对McChi5基因可能的生物功能和应用作了进一步的讨论.     

利用重组大肠杆菌合成几丁寡糖的研究

提取根瘤菌Mesorhizobium.loti基因组,克隆编码N-乙酰氨基葡萄糖转移酶nodC基因,插入质粒pUC19的lac启动子的下游,构建并筛选出能够合成几丁寡糖的重组大肠杆菌DCL-3。利用优化的MMYNG培养基,重组大肠杆菌DCL-3在10L发酵罐中培养26h后,培养液菌体浓度测定OD560=10.8,几丁寡糖得率达到526mg/L。收集重组细菌的细胞并煮沸破碎,利用活性炭的吸附和P4凝胶层析对几丁寡糖产物进行分离纯化。纯化产物的液质分析(LC-ESI-MS)结果表明主要寡糖产物为几丁四糖(m/z,831[M H] )和几丁五糖(m/z,1034[M H] )。     

高等植物几丁酶研究进展

几丁醇是一种分解聚N—乙酰胺基葡萄糖分子的糖苷酶,普遍存在于自然界。高等植物中,几丁酶虽然普遍存在,但迄今没有发现底物。因此,高等植物几丁酶的功能是个十分吸引人而又研究不多的问题。本文介绍高等植物几丁酶的分布、酶学性质,基因结构和可诱导性等研究结果。并介绍了几丁酶在植物抗真菌病中的作用的研究进展。     

几丁糖预防术后肠粘连的实验研究

选用SD大鼠60只,制成肠粘连模型,用几丁糖,右旋糖酐治疗,并与对照组比较。结果显示几丁糖有防止肠粘连的作用,同一浓度的右旋糖酐无此作用。     

来源于家蝇、地鳖虫、黄粉虫和河虾壳几丁糖的基本特性

为了了解昆虫来源几丁糖的基本特性及其与河虾来源几丁糖的差别,用同一方法在相同条件下分别以河虾壳(shell of Procambarus clarkii)、家蝇蛹壳(pupa shell ofMusca domestica vicinaMacquart)、地鳖虫壳(shell of Euplyphaga Walker)和黄粉虫蜕(exuviate of Tnebrio molitorL.)为来源制备的几丁糖在灰份、脱乙酰度、分子质量等及红外图谱上进行比较研究。昆虫来源几丁糖,其灰份低于河虾壳来源几丁糖;家蝇蛹壳几丁糖分子质量明显低于其他3种来源的几丁糖;从几丁糖质量角度看,采用家蝇蛹壳和地鳖虫壳可制备脱乙酰度较高的几丁糖;4种来源的几丁糖红外光谱图谱基本一致,具有几丁糖的特征吸收峰。     

几丁酶及其在植物抗真菌病中的作用

几丁酶(E G 3 2.1.14)是一种糖苷酶,在高等植物中普遍存在。其底物几丁质是一种由N-乙酰胺基葡萄糖聚合而成的多糖。至今未在植物体内发现此物质,但几丁质是许多危害植物的病原菌(如霉菌)的细胞壁的主要成分之一。因此人们自然联想到高等植物几丁酶在防御病原菌侵染中的可能作用。自本世纪30年代发现高等植物几丁酶活性以来,研究者们对几丁酶理化性质、生物学功能、可诱导性等方面做了些研究工作。     

长江三峡东部早奥陶世早期的几丁虫

该文介绍了国内外关于早奥陶世早期的几丁虫研究现状,描述了峡东地区早奥陶世早期分乡组的几丁虫3属6种:Conochitina symmetrica,Conochitina cf.pomoti,Conochitina sp.A,Conochitina sp.B,Lagenochitina cf.combazi,Cyathochitina sp.。根据共生的笔石和牙形石以及这些几丁虫在世界其它地区的地质分布,讨论了其时代与对比问题。指出了长江三峡东部早奥陶世早期的几丁虫面貌与世界各地同期几丁虫生物古地理的亲缘关系。     

卡拉胶酶的来源、性质、结构与应用研究进展

卡拉胶作为构成红藻植物细胞壁的主要成分,是一种由D-半乳糖通过交替的α-1,3和β-1,4糖苷键连接而成的线性硫酸多糖。由于具有良好的成胶能力和化学稳定性,卡拉胶作为增稠剂和胶凝剂等添加剂在食品和化妆品行业中得到了广泛的应用。卡拉胶酶属于糖苷水解酶,可以将卡拉胶降解成一系列偶数聚合度的寡糖。卡拉胶寡糖由于具有抗炎、抗凝和抗肿瘤等多种功能,引起了相关研究者的持续关注。因此,通过筛选、表征或者改造等手段获得具有优良特性的卡拉胶酶成为目前红藻多糖资源开发领域的研究热点。特别是,数十种不同来源的卡拉胶酶已经被分离、鉴定和表征,大大丰富了红藻多糖水解酶的研究领域。根据酶的底物专一性,可将其分为三类：λ-、ι-和κ-卡拉胶酶。本文综述了卡拉胶酶的来源、分类及生化特性的最新进展。此外,还详细介绍了不同家族卡拉胶酶的结构特点和催化机制,并讨论了卡拉胶酶在制备功能性寡糖方面的应用前景。     

环状芽孢杆菌C—2几丁酶基因在大肠杆菌中的表达

对已克隆的环状芽孢杆菌Ｃ－２的几丁酶基因片段所作的亚克隆分析表明,该几丁酶基因位于１．７ｋｂ Ｐｓｔ Ｉ－Ｓｔｙ Ｉ片段 。ＣｈｉＩ基因在大肠杆菌ＪＭ１０７,ＤＨ５α,ＸＬ１－ｂｌｕｅ,ＴＧ－１等菌株中均能表达,但表达水平不同,其中ＪＭ１０７的表达活性最高,其胞外几丁酶活性与供体菌Ｃ－２菌株的胞外酶活性几乎相当。     

免疫亲和层析法纯化苦瓜几丁酶

用扁豆几丁酶免疫家兔,获得抗扁豆几丁酶的抗体,将此抗体与Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ偶联,制备免疫亲和吸附剂,用以纯化苦瓜几丁酶．苦瓜叶片的粗提液经过免疫亲和吸附柱后,可获得电泳纯的几丁酶,其分子量为３５ ｋＤ,与用几丁质凝胶为亲和吸附剂的纯化结果一致．表明利用植物几丁酶在结构上的保守性,用免疫亲和法可纯化不同植物的同类几丁酶．与几丁质凝胶亲和柱相比,免疫亲和法纯化植物几丁酶具有快速、亲和柱可重复使用等的优点．利用免疫亲和层析获得的纯化样品,研究了苦瓜几丁酶对真菌的抑制试验,研究结果表明,苦瓜几丁酶能分解棉花枯萎病菌的菌丝体细胞壁制备物,并对其孢子芽管的伸长有一定抑制作用．     

香蕉采后炭疽病发生与几丁酶,β—1,3—葡聚糖酶和多巴胺的关系

几丁酶,β－１,３－葡聚糖酶随着香蕉采后炭疽病的发展过程,活性逐渐增加。但当果实出现明显病害症状时活性略有下降。施保功处理在抑制香蕉 采后炭疽病发生的同时也抑制了香焦采后炭疽病发生的同时也抑制了芭蕉炭疽菌可能诱导的几丁酶和β－１,－３葡聚糖酶活性的增加。     

蝇蛆几丁低聚糖对草莓保鲜作用研究

两种蝇蛆几丁低聚糖对7种草莓病原菌的抑制作用,试验结果表明酶解几丁低聚糖的抑菌活性显著高于H2O2水解几丁低聚糖,质量浓度10g/ml时,它对草莓灰霉菌等6种病原菌有强烈的抑制作用,抑菌效果在80%以上,但对草莓白粉菌的抑制作用一般;H2O2水解几丁低聚糖对草莓灰霉菌等4种病原菌也有很好的抑制效果,对草莓黑霉病菌等3种病原菌的抑制作用较差.盆栽试验结果表明蝇蛆几丁低聚糖喷雾处理可以减少生长期草莓果实的发病率,处理后第3天即表现出一定的防病效果,处理后第6天防病效果最佳,处理后第9天,防病效果开始有所下降.涂膜处理试验结果表明,在常温下,10～20mg/ml几丁低聚糖溶液处理,可使草莓的保存期延长2～3天.     

糖类结构研究的若干进展

近几年糖类的结构测定有一定的进展。本文介绍了高效液相层析(HPLC)在糖类结构研究中的若干新的应用,其中包括:单糖和寡糖的高效阴离子交换层析和脉冲安培检测器的应用;寡糖的二维HPLC以及HPLC和电子计算机联用测定影响HPLC的一些参数,进而利用有关参数和HPLC的行为预测寡糖的结构。