应用Red重组工程技术建立asd基因缺失的大肠杆菌DH10B菌株

目的:建立一株新遗传表型的大肠杆菌DH10BΔasd菌株。方法:应用pKD46介导的重组系统、kan/kil选择反选择系统、双链线性DNA重组技术和重叠引物介导的DNA重组技术,在菌株DH10B体内,对其染色体上的asd基因进行了基因敲除。结果:建立了一株二氨基庚二酸(DAP)营养缺陷型重组大肠杆菌DH10BΔasd。结论:为进一步建立以大肠杆菌DH10B为载体的DNA疫苗或基因治疗载体奠定了基础。     

pBR322-Red介导的E．Coli染色体基因敲入、位点及表达研究

应用pBR322-Red介导的重组工程系统,Kan/sacB选择反选择系统,双链线性DNA重组技术和重叠引物介导的DNA重组技术,将长度为1 653 bp的luc报告基因分别敲入到E.coli W3110染色体lacZ, lacY和lacA基因的位置,建立了一系列具有新遗传表型的菌株：CWL2、CWL4和CWL6。荧光素酶分析表明,外源报告基因luc能在这3个结构基因处有效的组成型表达。为了进一步确定外源基因的表达情况,用霍乱毒素B亚单位基因ctxb替换了lacZ基因,构建了新菌株CWD1。证明了以单拷贝形式存在在大肠杆菌染色体CWD1上的ctxb基因能有效的表达CTB蛋白并能将其分泌至细胞外培养液中。结果初步确定了大肠杆菌染色体上的lac操纵子结构基因位点适合外源基因的敲入和表达。     

pBR322-Red介导的E.coli染色体基因敲入、位点及表达研究

应用pBR322-Red介导的重组工程系统,kan/sacB选择反选择系统,双链线性DNA重组技术和重叠引物介导的DNA重组技术,将长度为1 653 bp的luc报告基因分别敲入到E.coli W3110染色体lacZ,lacY和lacA基因的位置,建立了一系列具有新遗传表型的菌株:CWL2、CWL4和CWL6.荧光素酶分析表明,外源报告基因luc能在这3个结构基因处有效的组成型表达.为了进一步确定外源基因的表达情况,用霍乱毒素B亚单位基因ctxb替换了lacZ基因,构建了新菌株CWD1.证明了以单拷贝形式存在在大肠杆菌染色体CWD1上的ctxb基因能有效的表达CTB蛋白并能将其分泌至细胞外培养液中.结果初步确定了大肠杆菌染色体上的lac操纵子结构基因位点适合外源基因的敲入和表达.     

ompC突变造成大肠杆菌在碱性条件下对渗透压敏感

大肠杆菌DH42突变株碱性条件下对高渗透压敏感。采用mini-Tn5转座突变质粒,同源重组构建突变菌株和DNA片段亚克隆等技术确定了造成大肠杆菌DH42在碱性条件下,对高渗透压敏感的原因是ompC基因突变。通过P1转导,构建了大肠杆菌D9（W3110 ompC：：kan）菌株。比较D9菌株和DH42菌株在不同pH和不同盐浓度条件下的生长,发现大肠杆菌ompC基因是大肠杆菌在碱性条件下应对高渗透压环境胁迫的必须基因。     

一种快速、精确构建大肠杆菌组氨酸营养缺陷型的方法

将表达Red体内重组蛋白的质粒pKD46转化大肠杆菌：DH5α,用5′端与组氨酸基因同源,3′端与卡那霉素抗性基因同源的引物获得具有卡那霉素抗性基因的PCR产物,然后电击转化DH5α,在λRed重组系统的帮助下,通过卡那霉素抗性基因两侧的组氨酸基因序列在体内与大肠杆菌染色体上的组氨酸基因发生同源重组,置换了DH5α组氨酸操纵元中的hisDCB基因,最后利用卡那霉素抗性基因两端的FRT位点,通过FTP位点专一性重组将卡那霉素抗性基因去除,最终获得了不具抗性的大肠杆菌组氨酸营养缺陷型菌株。为在大肠杆菌及其他菌株中快速、精确的构建营养缺陷型菌株提供了有益的参考。     

大肠杆菌ptsG基因敲除及其缺陷株生长特性研究

在大肠杆菌磷酸转移酶系统中,葡萄糖主要由ptsG基因编码的酶ⅡCB^Glc转运入细胞。利用代谢工程技术构建ptsG基因缺陷株,有望降低葡萄糖的摄取速率,减少乙酸累积,促进菌体生长。运用PCR技术,扩增出两翼与ptsG基因上下游序列同源,中间为氯霉素抗性基因的DNA片段。经电转化,将外源DNA片段分别转入Escherichia coli DH5α、JM109中。在Red重组酶的作用下,外源DNA片段与染色体上同源区域重组,将基因ptsG敲除,构建ptsG基因缺陷株DH5αP、JM109P。在LB培养基中,ptsG基因缺陷株的生长状况与亲株无明显差异。在含有葡萄糖的LB培养基中,DH5αP、JM109P的最高菌密度分别是对照菌株DH5α、JM109的3.47倍和4.25倍,ptsG基因缺陷株对葡萄糖的摄入量也明显高于对照菌株。重组蛋白肿瘤坏死因子（TNF）在DH5αP、JM109P中的表达量分别占全菌蛋白的24.3%、20.8%,A600分别为8.28、7.62,TNF在缺陷株中单位体积的表达量明显高于对照菌株。以上结果说明,大肠杆菌ptsG基因缺陷株具有良好的生长能力和表达外源蛋白的能力,在大肠杆菌高密度发酵研究方面具有良好的应用前景。     

Gap-Repair方式建立一种基于pBR322-Red的新型重组工程系统

应用Gap—Repair新技术,以pBR322为载体,在λ噬菌体Red重组酶的作用下,通过同源重组直接从大肠杆菌DY330染色体上亚克隆了长度为6．7kb的包含Red重组酶基因的λ噬菌体左向操纵子基因序列。建立了一种能够随意在不同细菌宿主中转移的基于pBR322-Red的重组工程系统。为了验证pBR322-Red的生物功能,以大肠杆菌染色体上的galk基因为靶标,用Red介导的单链DNA重组技术敲入T→G单碱基突变,使galk基因内编码第145位氨基酸的密码子由TAT转变成TAG,产生了一个琥珀突变。确定了pBR322-Red系统的重组功能。     

大肠杆菌ptsG基因敲除及其缺陷株生长特性研究

在大肠杆菌磷酸转移酶系统中,葡萄糖主要由ptsG基因编码的酶ⅡCB^Glc转运入细胞。利用代谢工程技术构建ptsG基因缺陷株,有望降低葡萄糖的摄取速率,减少乙酸累积,促进菌体生长。运用PCR技术,扩增出两翼与ptsG基因上下游序列同源,中间为氯霉素抗性基因的DNA片段。经电转化,将外源DNA片段分别转入Escherichia coli DH5a、JM109中。在Red重组酶的作用下,外源DNA片段与染色体上同源区域重组,将基因ptsG敲除,构建ptsG基因缺陷株：DH5αP,JM109P。在LB培养基中,ptsG基因缺陷株的生长状况与亲株无明显差异。在含有葡萄糖的LB培养基中,DH5αP、JM109P的最高菌密度分别是对照菌株DH5α,JM109的3．47倍和4．25倍,ptsG基因缺陷株对葡萄糖的摄入量也明显高于对照菌株。重组蛋白肿瘤坏死因子(TNF)在DH5αP、JM109P中的表达量分别占全菌蛋白的24．3％、20．8％,A600分别为8．28、7．62,TNF在缺陷株中单位体积的表达量明显高于对照菌株。以上结果说明,大肠杆菌ptsG基因缺陷株具有良好的生长能力和表达外源蛋白的能力,在大肠杆菌高密度发酵研究方面具有良好的应用前景。     

Red体内同源重组介导的egfp、kan基因融合和重组质粒构建

重组工程是近年来建立的一种基于高效率体内同源重组的新型遗传工程技术,可应用于靶DNA序列的敲入、敲除和基因克隆等。在应用重组工程技术进行基因亚克隆时发现,体外重叠PCR法难以获得高质量的目的DNA打靶片段,严重影响重组效率。为了解决上述问题,根据Red重组酶介导的体内同源重组工作原理进行了技术改进。先用PCR方法合成egfp和kan两条末端互补的线性DNA片段,然后将其电击共转化进入携带Red重组酶和pcDNA3．1载体DNA的大肠杆菌DY331菌株内,经体内同源重组直接产生的pcDNA3.1—egfp-kan环状重组质粒DNA分子可通过抗生素标记筛选获得,阳性率可达到45％。瞬时转染pcDNA3．1-egfp-kan可获得绿色荧光蛋白在293细胞中的表达。     

大肠杆菌ptsG和ptsM突变体的构建及特性研究

目的：敲除大肠杆菌DH5α中与葡萄糖磷酸化转运相关的ptsG、ptsM基因,考察缺陷株生长特性及其可能的应用。方法：PCR扩增靶基因,构建两翼带有靶基因序列并嵌合抗药基因标记的线性片段,利用Red同源重组技术敲除靶基因。结果：成功敲除了大肠杆菌DH5α的ptsG和ptsM基因;在含有葡萄糖的LB培养基中,DH5αΔptsG最高菌密度是亲本的2.8倍,添加吡咯喹啉醌或导入其生物合成基因后能够产酸;DH5αΔptsM最高菌密度是亲本的4/10,有明显的产酸现象。结论：DH5αΔptsG可用于大肠杆菌高密度发酵和吡咯喹啉醌生物合成基因缺陷株筛选。     

基于大肠杆菌受体菌DH5α △asd缺失株的构建及作为基因转化、表达操作系统的评估

基于大肠杆菌(E.coli)染色体上asd基因的已知序列,利用λ噬菌体的Red同源重组系统一步法构建E.coliDH5α的asd基因缺失突变株DH5α△asd::cat,在二次重组中利用携带能够表达FLP位点特异性重组酶的质粒pCP20介导二次同源重组,以去除上述缺失突变株中氯霉素抗性筛选基因。结合PCR扩增和测序结果,证明DH5α△asd缺失突变株的正确构建。该缺失突变株失去了在普通LB培养基上生长的能力,只有添加DAP或导入表达asd基因的质粒(asd基因互补试验)才能在LB培养基上生长,与原型DH5α比较,其生长速度和生长对数期、接受不同拷贝数质粒的转化效率几乎相一致。基于该缺失突变株构建出以asd营养基因为标志的大肠杆菌染色体-质粒平衡致死系统。体外培养连续传代50代次,pnirBMisL-fedF-asd质粒不丢失,并功能性表达F18大肠杆菌黏附素FedF。     

Red体内同源重组介导的egfp、kan基因融合和重组质粒构建

重组工程是近年来建立的一种基于高效率体内同源重组的新型遗传工程技术,可应用于靶DNA序列的敲入、敲除和基因克隆等。在应用重组工程技术进行基因亚克隆时发现,体外重叠PCR法难以获得高质量的目的DNA打靶片段,严重影响重组效率。为了解决上述问题,根据Red重组酶介导的体内同源重组工作原理进行了技术改进。先用PCR方法合成egfp和kan两条末端互补的线性DNA片段,然后将其电击共转化进入携带Red重组酶和pcDNA3.1载体DNA的大肠杆菌DY331菌株内,经体内同源重组直接产生的pcDNA3.1-egfp-kan环状重组质粒DNA分子可通过抗生素标记筛选获得,阳性率可达到45%,瞬时转染pcDNA3.1-egfp-kan可获得绿色荧光蛋白在293细胞中的表达。     

Red体内同源重组介导的egfp、kan基因融合和重组质粒构建

重组工程是近年来建立的一种基于高效率体内同源重组的新型遗传工程技术,可应用于靶DNA序列的敲入、敲除和基因克隆等。在应用重组工程技术进行基因亚克隆时发现,体外重叠PCR法难以获得高质量的目的DNA打靶片段,严重影响重组效率。为了解决上述问题,根据Red重组酶介导的体内同源重组工作原理进行了技术改进。先用PCR方法合成egfp和kan两条末端互补的线性DNA片段,然后将其电击共转化进入携带Red重组酶和pcDNA3.1载体DNA的大肠杆菌DY331菌株内,经体内同源重组直接产生的pcDNA3.1-egfp-kan环状重组质粒DNA分子可通过抗生素标记筛选获得,阳性率可达到45%,瞬时转染pcDNA3.1-egfp-kan可获得绿色荧光蛋白在293细胞中的表达。     

pBR322-Red在大肠杆菌lac操纵子基因敲除和敲入中的应用

pBR322-Red是一种新型重组工程系统,它携带了λ-噬菌体Red重组酶基因和一系列调控元件.对pBR322-Red最优重组条件进行探索后应用该质粒提供的体内同源重组功能,在菌株W3110体内,对染色体上的lac操纵子进行了基因修饰,包括:①运用kan/sacB选择反选择方法和重叠引物方法敲除了阻遏基因lacⅠ,②运用kan/sacB选择反选择方法和线性双链DNA介导的DNA重组方法将报告基因lacZ敲入lacA和lacY的位置,并且首次测定了报告基因lacZ在这三个结构基因位置的组成性表达情况.结果表明运用不同的重组策略,pBR322-Red系统都能方便有效地对大肠杆菌W3110染色体进行基因敲除和敲入修饰.     

一种快速精确编辑疱疹病毒基因组的方法

为了快速且准确地对疱疹病毒基因组进行基因敲除、插入或者点突变等修饰,通过同源重组将马立克氏病病毒 (MDV) 超强毒株Md5基因组克隆到细菌人工染色体 (BAC)。将筛选的阳性重组体DNA电转进DH10B菌株,用PCR及限制性片段多态分析 (RFLP) 方法鉴定含Md5全基因组的BAC克隆。将阳性重组体DNA转染入鸡胚成纤维细胞 (CEF),拯救出重组病毒,命名为Md5BAC。进一步利用Red酶介导的两步法基因重组技术构建MDVlorf10基因敲除毒株。为了验证被敲除基因功能的特异性,将lorf10插入原位点以构建基因复原毒株。将构建的重组毒株分别感染CEF细胞,用间接免疫荧光试验确认重组病毒均包装成功;病毒生长曲线结果表明,lorf10敲除不影响病毒的体外增殖。总之,这为其他疱疹病毒的基因组编辑提供了技术参考。     

大肠杆菌Zn2+敏感突变株构建及其功能验证

【背景】Zn²⁺在细胞解毒及许多生理过程中发挥着关键作用,Zn²⁺转运蛋白已逐渐引起人们的重视。在大肠杆菌中,zntA和zitB是2个外排Zn²⁺的关键基因。【目的】构建大肠杆菌Zn²⁺敏感突变株,并对其功能进行验证。【方法】以Escherichia coli DH5α为出发菌株,利用λ Red重组系统,通过携带卡那霉素抗性基因的同源重组片段敲除zntA基因。在单基因敲除菌株基础上,利用携带庆大霉素抗性基因的同源重组片段敲除zitB基因,获得一株敲除了zntA和zitB的双基因敲除菌株KZAB04。通过功能互补实验检测基因敲除菌株及对照菌株对不同浓度Zn²⁺的敏感程度。【结果】基因敲除菌株KZAB04比出发菌株E. coli DH5α具有更高的Zn²⁺敏感性。【结论】大肠杆菌Zn²⁺敏感突变株构建成功。该菌株的构建为zntA和zitB基因功能的研究提供了必要条件,同时也为其他Zn²⁺转运蛋白基因的功能鉴定与分析奠...     

用基于“Neo/E”的技术构建重组质粒

根据重组工程原理,建立了一种用于构建重组质粒的 “neo/E”（抗生素/单酶切位点）选择与反选择新方法。首先采用 PCR方法扩增出线性打靶分子：然后进行两步体内同源重组,（1）neo/E基因敲入,重组子呈现neo抗性表型;（2）目的基因替换neo/E基因。用限制酶E消化时,发生第二步重组的DNA分子不能被消化,能够转化大肠杆菌受体菌DH5α。应用该方法构建了重组质粒pGL3-Basic PC1900T。PCR及测序鉴定证明：外源片段重组率为20%,所建立的重组工程选择与反选择新技术为质粒构建提供了新的解决方案。     

一种快速、精确构建大肠杆菌组氨酸营养缺陷型的方法*

将表达Red体内重组蛋白的质粒pKD46转化大肠杆菌DH5α,用 5′端与组氨酸基因同源 ,3′端与卡那霉素抗性基因同源的引物获得具有卡那霉素抗性基因的PCR产物 ,然后电击转化DH5α,在λRed重组系统的帮助下 ,通过卡那霉素抗性基因两侧的组氨酸基因序列在体内与大肠杆菌染色体上的组氨酸基因发生同源重组 ,置换了DH5α组氨酸操纵元中的hisDCB基因 ,最后利用卡那霉素抗性基因两端的FRT位点 ,通过FTP位点专一性重组将卡那霉素抗性基因去除 ,最终获得了不具抗性的大肠杆菌组氨酸营养缺陷型菌株。为在大     

pSim6质粒与新型反选择kil系统联用在重组工程的应用

基因工程中,无痕修饰是一种很受欢迎的基因组操作技术。反选择系统的严谨性决定了无痕修饰的效率。近期有文献报道了一种新型的反选择系统kil,该系统与质粒pSim6联用后反选择严谨性较pKD46质粒更高,预示着kil与pSim6质粒联用可以更高效地选择出重组子。据此,对大肠杆菌菌株W3110、MG1655和DH10B中的4个不同的非必需基因位点(lacI、dbpa、ack和glk)进行了分析,将不同长度的外源基因片段对预先插入这些位点的tet/kil进行基因替换。结果表明kil与pSim6质粒联用较其与pKD46质粒联用,重组效率均有显著提高,并且随着外源片段的增长,效果更明显。外源片段为1 000 bp时,kil与pSim6质粒联用是其与pKD46联用的1.2–2倍;外源片段为2 000 bp时,则是pKD46的2.2–5倍。综上,kil与pSim6联用具有更高的重组效率,更有利于大肠杆菌基因组的无痕修饰操作,这为大肠杆菌重组工程提供了更多的选择。     

工业微生物代谢途径调控的基因敲除策略

基因敲除技术是一项重要的分子生物学技术,在工业微生物代谢工程中具有广泛应用。以下从基因敲除技术的遗传重组原理出发,总结了基因敲除策略的类型、特征和应用,重点介绍了采用线性双链DNA的λRed同源重组系统、使用环状质粒载体介导的单交换或双交换同源重组策略以及采用转座酶介导的转座重组等几种主要的基因敲除方法,进一步展望了基因敲除技术的发展前沿和应用前景。