坛紫菜（Porphyra Haitanensis）中抑菌活性肽的制备与初步纯化

目的:提取坛紫菜中水溶性蛋白,并对其进行初步纯化和抑菌活性影响因素研究。方法:坛紫菜水溶性蛋白胃蛋白酶在37℃、pH1.8条件下酶解3h,再经超滤、Bio-Gel P-10和DEAE Sephadex A-50层析纯化步骤得到一定分子量范围的多肽混合物。采用平板打孔法和对金黄色葡萄球菌的抑制作用,跟踪测定活性多肽纯化过程及其活性影响因素。结果:SDS-PAGE测定结果表明该抗菌多肽分子量介于43.0KD~66.2KD之间。它对金黄色葡萄球菌生长的抑制作用随着温度的升高逐渐减弱,5%EDTA、5%柠檬酸、5%维生素C及25%二甲基亚砜对它的抑菌活性有协同作用,而5%维生素E则对它的抑菌活性有拮抗作用。结论:从坛子菜水溶性蛋白中初步纯化得到的分子量介于43.0KD~66.2KD的多肽,对金黄色葡萄球菌的生长有明显地抑制作用,并且它的抑菌活性受到温度,部分有机酸和维生素的影响。     

苦瓜核糖体失活蛋白的分离纯化及其抑制烟草花叶病毒活性

目的:探讨分离纯化苦瓜种子核糖体失活蛋白(RIP)的方法,并研究利用纯化后的RIP抑制烟草花叶病毒(TMV)的活性。方法:用盐溶液抽提总蛋白后,经30%～90%的(NH4)2SO4分级沉淀,制成粗提液。用CMSepharoseFastFlow离子交换层析结合SephadexG-75凝胶柱分离纯化RIP。结果与结论:经SDS-PAGE检测及RNAN-糖苷酶活性鉴定,确定最终得到的蛋白为苦瓜RIP;所纯化的RIP对感染黄瓜和番茄的TMV有明显的抑制作用,但RIP的浓度并不与其抑制TMV的活性呈正相关。     

膜荚黄芪种子中2种几丁质酶的分离纯化及活性测定

运用传统的层析技术对膜荚黄芪种子中两种几丁质酶进行分离纯化,并对分离纯化中各个步骤得到的蛋白进行了活性研究.结果表明:(1)粗提液的硫酸铵沉淀经再生几丁质亲和柱和凝胶过滤层析Sephadex G-75得到几丁质酶A.(2)粗提液的硫酸铵沉淀经离子交换色谱DE-52、CM、凝胶过滤层析Sephadex G-75得到几丁质酶B.(3)几丁质酶A、B的比活性分别为35.6 U/mg和4.1 U/mg.(4)从膜荚黄芪种子中分离纯化的几丁质酶A和B均为糖蛋白,含糖量分别为6.1%和5.8%.(5) SDS-PAGE显示,几丁质酶A、B的分子量分别为35.5 ku、39.6 ku;凝胶过滤层析测定几丁质酶A、B的分子量分别为36.9 ku、40.8 ku;表明几丁质酶A、B均为单亚基蛋白.     

坛紫菜（Porphyra Haitanensis）中抑菌活性肽的制备与初步纯化

目的：提取坛紫菜中水溶性蛋白,并对其进行初步纯化和抑菌活性影响因素研究。方法：坛紫菜水溶性蛋白胃蛋白酶在37℃、pH1.8条件下酶解3h,再经超滤、Bio-Gel P-10和DEAE Sephadex A-50层析纯化步骤得到一定分子量范围的多肽混合物。采用平板打孔法和对金黄色葡萄球菌的抑制作用,跟踪测定活性多肽纯化过程及其活性影响因素。结果：SDS-PAGE测定结果表明该抗菌多肽分子量介于43.0KD~66.2KD之间。它对金黄色葡萄球菌生长的抑制作用随着温度的升高逐渐减弱,5%EDTA、5%柠檬酸、5%维生素C及25%二甲基亚砜对它的抑菌活性有协同作用,而5%维生素E则对它的抑菌活性有拮抗作用。结论：从坛子菜水溶性蛋白中初步纯化得到的分子量介于43.0KD~66.2KD的多肽,对金黄色葡萄球菌的生长有明显地抑制作用,并且它的抑菌活性受到温度,部分有机酸和维生素的影响。     

眼镜蛇毒细胞毒素-4N的分离纯化及其对HSC-T6细胞的作用

为了得到高纯度眼镜蛇毒细胞毒素-4N,探索眼镜蛇毒中细胞毒素-4N(cytototxin-4N,CTX-4N)对大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC-T6)的增殖抑制作用。本研究采用DEAE-Sepharose CL-6B阴离子交换柱、Spehadex G-50凝胶层析柱、Macro-prep High S阳离子交换柱结合的方法对眼镜蛇毒蛋白进行分离纯化。在每一步分离纯化过程中,采用CCK-8法检测各蛋白峰组分对HSC-T6细胞的增殖抑制作用活性,收集增殖抑制作用最强的CTX-4N峰。经SDS-PAGE电泳鉴定蛋白纯度,Nano-LC-ESI-MS/MS质谱方法鉴定其组分,Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂检测CTX-4N对肝星状细胞(HSC-T6)的增殖抑制作用,从而确定其药理作用。经DEAE-Sepharose CL-6B阴离子交换柱、Spehadex G-50凝胶层析柱、Macro-prep High S阳离子交换柱分离纯化后得到一个电泳纯度的蛋白,蛋白质谱鉴定为CTX-4N,分子量约为9.605 k D。不同浓度的CTX-4N作用HSC-T6细胞24 h后,随着其浓度的增大对HSC-T6细胞增殖抑制作用越强,呈剂量-效应关系,IC_(50)为(12.836±0.045)μg/m L。因此,本研究建立一种眼镜蛇毒细胞毒素-4N的分离纯化方法,并确定了其对HSC-T6细胞的增殖抑制的药理作用随浓度的增加而增强,为进一步研究其药理作用提供一定的理论依据。     

酿酒酵母二腺苷四磷酸磷酸解酶Ⅰ片段的表达、纯化及晶体培养研究

[目的]为了培养用于X-衍射的酿酒酵母二腺苷四磷酸磷酸解酶Ⅰ的蛋白晶体,为研究该酶的三维结构和功能打下基础;[方法]构建了表达酿酒酵母二腺苷四磷酸磷酸解酶Ⅰ片段(Apaldn16)的表达质粒,用核苷酸序列分析证明了克隆片段的正确性.将重组载体转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3),经.IPTG诱导后,用SDS-PAGE检测了蛋白的表达情况.将粗蛋白用Ni-NTA亲和层析分离,收集组分进一步用Superdex 75分子筛纯化.纯化后的蛋白用SDS-PAGE和质谱检验其纯度和正确性,然后用悬滴气相扩散法进行了蛋白结晶条件的初筛.[结果]成功地用大肠杆菌可溶性地高效表达了Apaldn16蛋白.得到了分子量约为36 kD的单一蛋白条带,纯度在95%以上.质谱结果证明该蛋白纯度高,分子量正确.将纯化后的蛋白用悬滴气相扩散法进行晶体初筛,得到了针状簇晶.此晶体经SDS-PAGE检测,证明为Apaldn16蛋白晶体.[结论]利用大肠杆菌高效表达体系可以正确表达Apalan16蛋白,蛋白经过纯化后,用悬滴气相扩散法可以生长出针状晶体,适合于进一步的三维结构研究.     

银杏种仁中抗菌蛋白的纯化及性质

银杏果仁提取上清液经硫酸铵沉淀、CM—52离子交换柱层析和Sephadex G-50凝胶过滤层析后分离纯化出一种抗菌蛋白。SDS—PAGE分析结果表明,此蛋白分子量为13000,对热稳定;氨基酸组分分析表明,该蛋白含18种不同氨基酸,尤富含丙氨酸(Ala)和精氨酸(His)等,缺乏半胱氨酸(Cys);纯化的蛋白对黄瓜镰刀孢菌(Fusarium oxysporum)、瓜类炭疽菌(Colletotrichum orbiculare)、小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis)等真菌有很强的抑制作用,而且对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia Coli)等细菌也有一定的抑制作用。     

骆驼蓬种子中一种具抗肿瘤活性蛋白的分离纯化及鉴定

骆驼蓬种子经浸提、硫酸铵沉淀、CM阳离子交换层析和Superdex 75凝胶过滤层析分离纯化得到一种具有抗肿瘤细胞增殖活性的蛋白(命名为PhLTP),经Tricine-SDS-PAGE检测为单一蛋白条带,高效液相色谱检测其表观分子量为14.8 kDa左右,表明PhLTP是由两条相同的亚基组成的蛋白.采用Edman降解法对该纯化蛋白的N-末端进行氨基酸测序,其N-末端序列与其他植物非特异性脂转移蛋白相似.对PhLTP抗肿瘤活性进行研究,结果表明其对HeLa、Eca-109、MGC-9和BEL-7404细胞都有增殖抑制活性,其中对HeLa细胞增殖的抑制作用较好,并具有浓度和时间依赖性,其IC50为45 μg/mL.通过Hoechst33258染色观察细胞形态,发现PhLTP能诱导HeLa细胞发生凋亡.     

Beta proteobacterium sp.T1菌株产壳聚糖酶的分离纯化

目的:分离纯化Beta proteobacterium sp.T1菌株所产的壳聚糖酶.方法:采用(NH4)2SO4(20%～70%)分级盐析、阴离子交换树脂DEAE Cellulose 52柱层析、SephadexG-100柱层析技术进行分离纯化,采用SDS-PAGE鉴定酶的纯度、分子量.结果:经DEAE Cellulose 52柱层析,壳聚糖酶纯化了13.19倍;经Sephadex G-100柱层析,壳聚糖酶纯化了26.32倍.结论:纯化后的酶经SDS-PAGE鉴定已达到电泳纯,分子量29.5kDa.     

短芽孢杆菌低温弹性蛋白酶酶学特性分析

旨在从短芽孢杆菌(Bacillus brevis)XZE116发酵液中分离纯化低温弹性蛋白酶,并对酶学性质进行研究。利用硫酸铵分级盐析、DEAE-Sepharose阴离子交换层析和Sephadex G-75分子筛凝胶过滤层析等方法进行纯化。结果显示,分离纯化到了均一的酶蛋白,酶纯度提高了37.21倍,回收率为35.3%。SDS-PAGE及Sephadex G-75分子筛凝胶过滤层析显示酶蛋白为单亚基蛋白,分子量是32.6 kD。最适作用温度25℃。在pH7.5-10.5范围内酶活性及稳定性较高,最适作用pH9.0,Mg2+对酶有明显激活作用。丝氨酸蛋白酶特异性抑制剂强烈抑制酶活性,表明所纯化到的弹性蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶。酶对阴离子表面活性剂(0.1%SDS)、阳离子表面活性剂(0.1%CTAB)和非离子型表面活性剂(1%Tween80)均具有很强的稳定性。鉴于短芽孢杆菌XZE116弹性蛋白酶具有以上优良酶特性,它在肉品嫩化领域具有潜在的应用价值。     

海水小球藻抗菌蛋白的分离纯化及性质研究

海水小球藻(Chlorella pacifica)提取液经硫酸铵沉淀、DEAE-52离子交换层析和SephadexG-200凝胶过滤层析后分离纯化出1种抗菌蛋白.经SDS-PAGE测定,两个亚基的相对分子量分别为61 kD和70 kD;该抗菌蛋白对热稳定,氨基酸组成分析表明含17种氨基酸,其中谷氨酸的含量最高,其次为甘氨酸与天冬氨酸,胱氨酸的含量最低.在抗菌活性中,纯化的蛋白质对产黄青霉(Penicillium chrysogenum)和中华根霉(Rhizopus chinensis)有较强的抑制作用,对金黄色葡萄球菌(staphy lococcus aureus)和肠炎病病原菌(Ameromonas punctata)也有抑制作用,其抗真菌活性比抗细菌强.     

当归多糖APS-3c的结构特征及体外抗肿瘤作用的研究

中国当归粗多糖经阴离子交换纤维素柱(DEAE-sephadex A-25)、凝胶柱(Sephacryl S-400及Sephadex G100)色谱分离纯化,得淡黄色粉末状多糖APS-3c.采用高效尺寸排阻色谱、红外光谱、气相色谱和糖醛酸还原等方法进行了结构的初步分析,用四甲基偶氮唑蓝比色法观察APS-3e对多种肿瘤细胞的生长抑制作用.结果表明APS-3c为均一组分,分子量为1.4×104 Da,由阿拉伯糖.鼠李糖.葡萄糖-半乳糖-甘露糖-木糖-半乳糖醛酸(6.7:6.5:6.3:4.7:1.6:1.0:13.2)构成,是首次从中国当归中分离出的新型酸性多糖.APS-3c对人白血病HL-60细胞、人结肠癌SW1116细胞的增殖有一定的抑制作用.     

IGFBP-3高效可溶表达、纯化及生物学活性初步研究

克隆胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP-3)的cDNA片段,构建原核表达载体pET-DsBA-IGFBP3。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS中,诱导表达IGFBP-3融合蛋白(简称D-IGFBP3)。经检测融合蛋白主要以可溶形式表达。表达产物用His亲和层析柱纯化,获得了纯度超过95%的重组IGFBP-3融合蛋白。Western-blot结果表明在相应分子量处有一条特异性条带。细胞活性研究显示它对MCF-7细胞生长具有一定的抑制作用,且在体外具有与IGF-I结合的活性。     

红托竹荪菌托多糖的提取及抗肿瘤活性的初步研究

红托竹荪菌托经热水提取、酒精沉淀、脱蛋白后的粗多糖,其得率远大于其菌丝体和子实体的其他部位及香菇子实体.菌托粗多糖进一步用DEAE纤维素柱和Sephadex G-75分离纯化,得到两个组分DRVP1与DRVP2,对分离得到的主要多糖通过高效液相色谱(HPLC)、红外光谱(IR)等进行结构分析.DRVP1的相对分子质量(Mr)为1.47×104,红外光谱数据显示为β-型甘露糖苷.体外试验表明,红托竹荪菌托多糖的组分DRVP1对小鼠S180肉瘤有一定的抑制作用.     

姬松茸凝集素的分离纯化及性质

凝集素是一类能够识别特异性糖并与之非共价结合的蛋白或糖蛋白,因其具有特定的识别受体,故在免疫系统和发育过程中发挥了重要的作用。使用DEAE-Sepharose FF弱阴离子交换层析、SP-Sepharose强阳离子交换柱层析、Sephadex G-75分子筛凝胶层析对姬松茸凝集素进行分离纯化,研究理化因素对其凝血活性的影响及其抗菌活性。结果表明:纯化的样品经SDS-PAGE电泳分析得到单一条带,姬松茸凝集素是含有2个相同亚基的同源二聚体,其分子量都为1.20×10~5。纯化后的姬松茸凝集素相对粗提液的回收率为28.99%,纯化倍数为19.06倍。姬松茸凝集素对热有较好的耐受性,但温度为90℃时失去凝血活性;在强酸或强碱下丧失活性,最适pH为7～9;凝集活性不受金属离子的影响;葡萄糖是其专一性结合糖。姬松茸凝集素对褐腐菌的生长起到了明显的抑制作用,而对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、绿色木霉、西瓜枯萎病菌和黑曲霉的生长没有明显的影响。     

人骨骼肌肌钙蛋白C在大肠杆菌中的表达及其抗肿瘤作用

为了探索重组人骨骼肌型肌钙蛋白C(rhTnC)的抗肿瘤作用,采用PCR技术,从人乳腺cDNA文库中获得编码TnC的cDNA序列,在大肠杆菌中进行了表达.经镍柱亲和层析纯化后,分别检测其在体外对人脐静脉内皮细胞生长的抑制作用与对小鼠异位移植肿瘤(S-180)生长的抑制作用.结果表明,rhTnC在大肠杆菌中呈可溶性表达.分离纯化后的rhTnC在体外对人脐静脉内皮细胞生长呈剂量依赖性抑制(IC50为7.5μg/ml);对小鼠异位移植肿瘤的生长也有明显的抑制作用,在20mg/(kg·d)剂量下对S-180的抑制率为64.4%.以上结果说明,rhTnC可抑制血管内皮细胞生长,并具有抗肿瘤作用.     

抗HIV-1 p15(gag)IgY抗体的制备及活性检测

目的:制备具有高效价强特异性的抗HIV-1 p15(gag)鸡卵黄抗体(IgY),纯化并分析其免疫学活性。方法:用纯化的HIV-1 p15(gag)蛋白抗原免疫蛋鸡,用水稀释法对IgY抗体进行粗提取并结合乙醇沉淀和氯化钠盐析法纯化抗体,再通过SDS-PAGE、Western blot、酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抗体的纯度、特异性及效价。结果:表达纯化的HIV-1 p15(gag)-GST融合蛋白分子量为45kDa,用于抗体检测的抗原。用纯化的His-P15蛋白作为免疫原免疫蛋鸡后,获得的卵黄抗体重链、轻链分子量分别为65kDa和25kDa。8倍体积水稀释卵黄,pH值5.1,20%冰乙醇及0.028mol/L盐溶液分离纯化,纯度可达96℅,每毫升卵黄液可得到的卵黄抗体为9.8mg。终浓度为18%～25%的冰乙醇纯化的抗体浓度高且稳定,同时具有较强的特异性和较高的效价。结论:用HIV-1p15(gag)蛋白免疫蛋鸡,可以获得高效价的特异性抗体IgY,为IgY抗体在HIV-1p15蛋白的研究奠定了实验基础。     

家蝇变形期抗菌蛋白的提取及其抑菌活性研究

目的:分离纯化家蝇变形期体内抗菌蛋白并分析其抑菌作用.方法:对家蝇(Muscadomestica)5日龄幼虫进行针刺诱导,并于24h后挑取变形后的蛹,通过研磨、调酸、加热提取蛹体内的耐热水溶总蛋白,经过两步CM-sepharose F.F.离子交换层析分离,以金黄色葡萄球菌作指示菌,检测其抑菌活性,并用SDS-PAGE不连续电泳检测蛋白质的分子量.结果:经两步离子交换分离后,得到一种对金黄色葡萄球菌具有较强抑菌活性的蛋白,经SDS-PAGE检测为单一条带,其分子量为43kDa.结论:家蝇处于变形期时,经过诱导后体内能产生一种抑菌活力较强的蛋白质.     

SIgA分泌片分离、纯化研究

为研究SIgA分泌片（Secretory component,SC)分离,纯化及鉴定方法,以SC存在游离和结合两种形式,本研究应用凝胶过滤和盐析法直接从初乳中分离纯化游离SC,并进行鉴定。分离纯化获得蛋白溶液12.4ml,蛋白含量0.85mg/ml,免疫双扩仅与抗SC多克隆抗体（PcAb)反应,分子量约75kD,免疫印迹实验与抗SC单克隆抗体（McAb)和PcAb特异反应,表明纯化蛋白为SC。该SC的分离纯化和鉴定处于不断完善之中,其方法的改进有利于获得更纯的SC,值得粘膜免疫研究者借鉴。     

江浙蝮蛇蛇毒中抗肿瘤蛋白的分离纯化及活性研究

利用离子交换和凝胶过滤层析等分离技术从江浙蝮蛇蛇毒中分离纯化到一种抗肿瘤蛋白,经SDS-聚丙酰胺凝胶电泳检测其分子量为58．2ku。MTT法测定该蛋白对K562细胞的LC50为4．96μg／mL,电子显微镜观察其能引起K562细胞的凋亡,琼脂糖凝胶电泳可见典型的DNA梯状条带,实验结果表明该蛋白对K562细胞有明显的抑制作用。