空间搭载高产葡萄糖耐量因子(GTF)酵母的选育

以从本试验室收藏的7株酵母菌种及其7株经空间搭载(实践八号)诱变后的酵母菌株为研究对象, 通过梯度含铬YEPD平板培养和液体YPD培养基发酵试验, 利用氨水提取菌体中的GTF和火焰原子吸收光谱法检测其有机铬含量, 从中筛选出一株葡萄糖耐量因子的高产酵母(YS-3), 有机铬含量达1296 mg/g, 总铬含量达1926 mg/g, 生物量为40 g/L。同时分析了菌体发酵过程中, 菌体有机铬富集量与其它发酵参数的动态关系。     

高产葡萄糖耐量因子酵母的筛选及其发酵特性的研究

通过将供试菌株接种于梯度浓度含铬YEPD平板和液体YPD培养基中进行固体培养及液体发酵试验,利用氨水提取GTF和火焰原子吸收光谱法检测其有机铬含量,从本试验室收藏7株酵母菌种和7株经航天诱变育种的酵母菌种中筛选得到一株葡萄糖耐量因子的高产酵母,有行机铬含量达1287ug/g,总铬含量达1917ug/g.同时研究了菌体发酵过程中,菌体有机铬富集量和其发酵参数的动态关系.     

十子代平方水煎液对原代骨骼肌细胞胰岛素抵抗模型的影响

本实验观察十子代平方对原代骨骼肌细胞胰岛素抵抗模型的影响,探讨其改善胰岛素抵抗的作用机制。对原代骨骼肌细胞应用5×10-7mol/L胰岛素干预12 h建立胰岛素抵抗模型,应用十子代平方高、中、低浓度(400、100、25μg/m L)(SZDP-H、SZDP-M、SZDP-L)对造模成功的骨骼肌细胞进行干预,同时另设正常组、模型组,吡格列酮组(40μmol/L)作对照,药物干预24 h后用葡萄糖氧化酶法测定骨骼肌细胞上清液葡萄糖剩余量,采用Western-blot方法测定该方药物干预后骨骼肌细胞AKT、GSK-3β蛋白的表达。实验结果表明十子代平方可以改善骨骼肌细胞胰岛素抵抗模型的葡萄糖代谢,增加AKT和磷酸化位点Ser473蛋白表达,降低GSK-3β蛋白表达,增加其磷酸化位点Ser9蛋白表达。十子代平方可能通过调节AKT/GSK3β通路的机制改善胰岛素抵抗模型骨骼肌细胞的葡萄糖代谢。     

九里香多糖和蛋白多糖的分离、纯化和分析

九里香(Murraya Paniculata L.Jack)皮部经热水提取、乙醇沉淀、SephadexG—100柱层析分离、磷酸氢钙吸附、酸溶,再通过Sephadex G-200柱层析纯化,得到灰白色粉末状九里香蛋白多糖。总糖含量为52.1％(其中葡萄糖醛酸含量为10.9％),蛋白质含量为20.0％。九里香蛋白多糖去蛋白后,即得九里香多糖,总糖含量为88.2％(其中葡萄糖醛酸含量为20.0％),经纸层析和聚丙烯酰胺凝胶园盘电泳鉴定为单一斑点和单一区带。平均分子量约为1.7×10~(-5)。组成单糖的摩尔比为葡萄糖:露甘糖:木糖:阿拉伯糖:岩藻糖:葡萄糖醛酸=1.0:0.40:0.16:0.17:0.20:0.48.     

有机铬对实验性糖尿病大鼠胰岛β细胞形态结构及功能的影响

目的探讨有机铬(2-吡啶甲酸铬)对大鼠胰岛β细胞形态结构及内分泌功能的影响。方法首先通过尾静脉注射新鲜配制的1.5%四氧嘧啶溶液制备糖尿病大鼠模型;通过灌胃的方式提高糖尿病大鼠体内有机铬含量;治疗12周后,通过氧化酶法测定大鼠血清葡萄糖水平,利用免疫组织化学方法和放射免疫学方法分别观察大鼠胰岛β细胞形态结构的改变及大鼠血清胰岛素含量的变化。结果两治疗组大鼠血清葡萄糖水平明显下降,与糖尿病模型组相比,差异均有显著性;400μg治疗组大鼠体内胰岛素水平明显升高,与糖尿病模型组相比差异有显著性,而200μg治疗组大鼠血清胰岛素水平虽有所增加但与糖尿病组相比,差异无显著性;免疫组化显示治疗组大鼠胰岛β细胞数量增多,胞质内胰岛素免疫反应阳性颗粒明显增多。结论有机铬对糖尿病大鼠具有明显的降低血糖功能,并能促进受损胰岛及β细胞形态结构功能的恢复,对糖尿病大鼠病理状态具有明显的改善作用。     

核桃多肽对高糖诱导HepG2胰岛素抵抗模型的影响

摘 要：目的：探究核桃多肽在细胞水平上的降糖作用机制,为核桃资源开发利用提供科学依据。方法：在实验室提取的HT多肽,分离纯化HT-1、HT-2的基础上,通过GLUT4转膜活性筛选,L6肌管细胞葡萄糖摄取活性筛选以及高糖诱导HepG2细胞模型胰岛素抵抗实验,探究核桃多肽的降糖生物活性及降糖作用机制。结果：HT多肽、HT-1、HT-2均有一定的促GLUT4转膜活性,其中量效曲线趋势分布较好的为HT-2,15min开始响应,30min达峰值,在25min细胞膜上GLUT4增加1倍;葡萄糖摄取活性都较好,摄取率分别为1.16、1.06和1.36;IRβ、IRS-1蛋白、GLUT2蛋白的表达水平与HT-2呈浓度依赖性增加,表明HT-2通过胰岛素信号传导途径改善葡萄糖代谢。结论：HT多肽、HT-1、HT-2的降糖活性都较好,其中HT-2效果明显,且是通过胰岛素信号传导途径改善葡萄糖代谢。     

灵芝多糖对3T3-L1胰岛素抵抗细胞模型PI-3K p85和GLUT4蛋白表达的影响

目的 研究灵芝多糖对3T3-L1胰岛素抵抗细胞模型PI-3K p85和GLUT4蛋白表达的影响,探讨灵芝多糖改善胰岛素抵抗的分子机制.方法 3T3-L1前脂肪细胞经1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤、地塞米松、胰岛素诱导分化成3T3-L1脂肪细胞,以葡萄糖氧化酶法测定培养液中残余的葡萄糖含量.比较二甲双胍组,检测培养液中葡萄糖含量及PI-3K p85和GLUT4蛋白表达变化.结果 地塞米松联合胰岛素诱导3T3-L1脂肪细胞产生胰岛素抵抗,细胞对葡萄糖的摄取量减少.灵芝多糖可改善3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗.胰岛素抵抗细胞的PI-3K p85和GLUT4蛋白表达明显减少;应用灵芝多糖后,相关蛋白表达增加.结论 灵芝多糖通过提高PI-3K p85和GLUT4蛋白的表达,参与胰岛素抵抗状态下3T3-L1细胞的葡萄糖代谢.     

成纤维细胞生长因子(FGF)-21改善胰岛素抵抗肝细胞对葡萄糖的吸收和肝糖原的合成

在体外建立胰岛素抵抗肝细胞模型,探讨在胰岛素抵抗状态下成纤维细胞生长因子(FGF)-21对模型细胞糖代谢的影响及机制．将HepG2细胞置于10^-7 mol/L 的胰岛素培养基中培养24 h,建立胰岛素抵抗细胞模型．分别用不同浓度的胰岛素和FGF-21处理模型细胞,采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶(GOD-POD)法检测细胞对葡萄糖的摄取情况,并检查胰岛素与FGF-21的协同作用．利用实时荧光定量PCR检测FGF-21对模型细胞葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)mRNA表达的影响,蒽酮法检测模型细胞糖原合成量,探讨FGF-21对胰岛素抵抗细胞模型葡萄糖摄取的影响及机制．结果发现,用高浓度胰岛素处理HepG2细胞24 h后,细胞对胰岛素的敏感性显著降低,说明成功建立了胰岛素抵抗细胞模型,抵抗状态可维持48 h,未发现细胞形态学变化．FGF-21能改善胰岛素抵抗模型细胞的葡萄糖摄取,参与肝糖原的合成,并与胰岛素产生协同作用．实时荧光定量PCR结果发现,FGF-21作用模型细胞后,细胞的GLUT1 mRNA表达量显著增加,说明FGF-21促进模型细胞摄取葡萄糖的作用机制与其增加GLUT1的表达有关．     

枸杞多糖对HepG2细胞胰岛素抵抗的改善作用及机制研究

目的：观察不同浓度的枸杞多糖（LBP）对HepG2细胞胰岛素抵抗的影响并探讨其机制。方法：采用高糖高胰岛素处理HepG2细胞24 h建立胰岛素抵抗细胞模型后,用台盼蓝检测活力大于95%的HepG2细胞,以10⁴/孔密度接种于96孔板内,细胞贴壁后以30 μg/ml、100 μg/ml、300 μg/ml的LBP培养48 h,200 μl/well,各组均设4个复孔。检测不同浓度的LBP对HepG2细胞活性及胰岛素抵抗的影响;细胞内丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）的活性;各组细胞胰岛素信号转导通路中相关蛋白（IRS-2、PI3-K、Akt、GLUT2）的表达。结果：MTT显示：与正常对照组相比,IR模型组MDA含量显著升高,SOD活力明显降低,同时IRS-2、PI-3K、Akt、GLUT2蛋白表达水平明显下降;与IR模型组相比,中、高浓度LBP组MDA的含量明显降低,SOD的活力显著升高,且IRS-2、PI-3K、Akt、GLUT2蛋白表达水平明显升高;在相同的时间内,随着LBP浓度的增加,OD值逐渐降低;在同一浓度干预下,随着时间的延长,OD值也逐渐降低;葡萄糖消耗实验表明中、高浓度的LBP可显著提高胰岛素抵抗HepG2细胞的葡萄糖消耗量,而低浓度LBP对HepG2细胞葡萄糖消耗量无明显影响。结论：中、高浓度枸杞多糖能改善HepG2细胞胰岛素抵抗,其作用机制可能与降低细胞氧化应激水平及提高胰岛素信号传导通路相关蛋白表达有关。     

肌肉肌醇对HepG2 胰岛素抵抗模型葡萄糖消耗量影响的细胞实验研究

目的:研究肌肉肌醇(myo-inositol,MI)对胰岛素抵抗细胞(IR-HepG2)细胞外葡萄糖消耗量的影响。方法:采用CCK-8法观察MI、高糖对HepG2细胞活力的影响,通过高糖持续作用,胰岛素刺激诱导HepG2细胞建立胰岛素抵抗细胞模型,葡萄糖氧化酶法(GOD-POD法)鉴定模型是否成立,并用GOD-POD法检测正常HepG2细胞和MI对HepG2胰岛素抵抗细胞葡萄糖消耗量的变化。结果:在对HepG2细胞活性没有影响的情况下,MI增加了胰岛素抵抗模型的葡萄糖消耗量。与模型对照组相比,葡萄糖氧化酶法结果显示,MI可显著增加胰岛素抵抗模型葡糖糖的消耗量(P0.01)。结论:MI可明显增加IR-HepG2细胞模型葡萄糖的消耗量,对IR-HepG2细胞模型胰岛素抵抗有显著的改善作用。     

MDCK细胞宿主蛋白含量双抗体夹心ELISA检测方法的建立

目的建立检测犬肾细胞(madin-darby canine kidney, MDCK)宿主细胞蛋白(host cell protein, HCP)含量的双抗体夹心ELISA。方法从MDCK细胞中提取细胞总蛋白,免疫新西兰兔制备兔抗MDCK细胞蛋白多克隆抗体,抗体经辛酸-硫酸铵沉淀和Protein A层析纯化后,采用SDS-PAGE分析抗体纯度,Western blot检测抗体特异性。用纯化的多克隆抗体作为包被抗体,并采用改良过碘酸钠标记法制备酶标抗体,建立ELISA并确定包被抗体浓度和辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体稀释度等最适条件。确定该方法较佳的线性范围及检测限,并对该法特异性、准确度、精密性和重复性进行验证。最后,用该方法分别对接种流感病毒的MDCK细胞上清收获液和纯化样品进行MDCK细胞蛋白含量检测,初步验证其在纯化工艺开发中的适用性。结果通过免疫新西兰兔制备了高滴度的兔抗MDCK细胞蛋白多克隆抗体血清,滴度可达1∶8 000。纯化后的兔抗MDCK细胞蛋白多克隆抗体纯度>90%,并可与MDCK细胞蛋白特异性结合。建立的双抗体夹心ELISA的理想包被抗体质量浓度为10μg/mL,酶标抗体的工作浓度为1∶500稀释。该方法的线性范围为50~2 500 ng/mL,检测限为50 ng/mL;该方法对Vero细胞、293T细胞和Mrc-5细胞等其他细胞HCP无交叉反应,特异性良好;不同浓度的MDCK细胞HCP回收率在98.5%~111.9%之间,变异系数均<10%。接种流感病毒的MDCK细胞培养上清经多步纯化后MDCK细胞蛋白质量浓度逐渐降低至<900 ng/mL,纯化工艺可有效去除MDCK细胞蛋白残留。结论建立双抗体夹心ELISA检测MDCK细胞残余HCP含量的方法,可用于基于MDCK细胞培养的流感疫苗下游工艺开发中宿主细胞残留HCP含量监测。     

大鼠胰岛β细胞GPR40表达与内脏脂肪含量及胰岛素分泌的关系

目的:观察SD大鼠胰岛β细胞G蛋白偶联受体40(GPR40)的表达与内脏脂肪含量及胰岛素1相分泌之间的关系.方法:大鼠按体质量分为3组(100 g、200g及300 g组),行静脉糖耐量实验,胶原酶原位灌注法分离胰岛,免疫组织化学法结合激光扫描共聚焦显微镜技术对胰岛β细胞表达的GPR40进行定位,并行半定量分析.结果:随着大鼠体质量的增加,内脏脂肪含量明显增加,300g组大鼠胰岛β细胞GPR40表达较100g及200g组明显增加,3组大鼠胰岛素1相分泌无显著差异.结论:GPR40表达的变化可能与内脏脂肪含量及年龄因素有关,其表达水平对正常大鼠葡萄糖刺激的胰岛素分泌无明显影响.     

猪脂肪GLUT4蛋白的大量提取纯化及鉴定

目的:寻找提取纯化具有12次跨膜结构的葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)的新方法,并通过晶体结构的解析来研究二型糖尿病的发生机制。方法:首次选用猪肉皮下脂肪作为GLUT4蛋白提取的原材料,采用组织匀浆,差速离心方法初步提取分离了富含GLUT4的组分,进一步通过硫酸铵沉淀法初步纯化到大量的GLUT4蛋白。结果:通过单抗1F8对每一个组分进行Westem Blot检测,证明了分子量55kD处的蛋白即是GLUT4。150g脂肪组织通过组织匀浆和差速离心后,于35%-55%的硫酸铵沉淀浓度范围内得到40mg纯度达到50%的GLUT4。纯化后的GLUT4可以在0.5%DM下稳定存在三天。结论:发展了快速有效提取GLUT4的新方法,为进一步蛋白结晶打下基础。     

一种高效经济的小鼠胰岛细胞分离纯化新技术

目的:建立一种经济高效的小鼠胰岛细胞分离纯化方法,为进行NOD小鼠的胰岛移植提供实验条件.方法:将5-7周龄、体重20～25 g的雄,陛昆明小鼠的胆总管结扎,并逆行Hank's液和胶原酶P灌注和分离消化,依次加入84%、67%、50%浓度的Histopaque介质后进行不连续密度梯度离心纯化胰岛细胞.双硫腙(dithizon,DTZ)和台盼兰染色分别鉴定胰岛细胞.用含5.6mmol/L葡萄糖DMEM培养液体外培养胰岛细胞,培养后的第3、5、7、9、11天取细胞上清检测胰岛素水平,并用16.7mmol/L的高浓度葡萄糖进行刺激,检测胰岛素水平确定胰岛细胞功能.结果:每个胰腺的胰岛细胞收获量在1200±124个,且纯度和活性均大于90%;体外培养9天内胰岛细胞基础胰岛素分泌水平无显著差异,至第11天时则明显减少(P＜0.05);应用16.7mmol/L葡萄糖刺激后,第5、7、9、11天的胰岛素分泌水平较第3天的明显减少(P＜0.05),然而在第7天、9天、11天时的胰岛素水平较第5天时显著降低.结论:胆总管逆行注射Hank's液和胶原酶P消化消化和不连续密度梯度Histopaque纯化的方法可以获得大量状态良好的胰岛,且胰岛细胞数量多,分泌状态良好.本分离方法是一种经济高效的胰岛细胞分离方法,同时离体后于5.6mmol/L葡萄糖DMEM培养第3天胰岛细胞胰岛素储备功能最佳,为移植研究的最佳状态.     

药用与食用黄精次生代谢产物差异分析及改善胰岛素抵抗的活性成分与作用机制研究CSCD

本研究以药用黄精与食用黄精为研究对象,分析其次生代谢产物差异,并对差异成分中改善胰岛素抵抗(IR)的潜在活性成分与作用机制进行预测分析及验证。采用UHPLC-ESI-MS/MS广泛靶向代谢组学技术检测药用与食用黄精次生代谢产物;将差异代谢物相对含量变化前十且上调的化合物进行改善胰岛素抵抗的网络药理分析,并进行分子对接验证;选取HepG2细胞,运用高糖培养基和高浓度胰岛素联合诱导胰岛素抵抗模型进行细胞实验验证。结果从药用与食用黄精样品中共鉴定出319个成分,其中差异成分106个。PCA及HCA聚类分析结果表明药用与食用黄精次生代谢产物含量存在明显差异。网络药理分析表明,异鼠李素、野漆树苷、异野漆树苷等5个上调化合物与IR疾病靶点相重合,交集靶点59个,主要涉及PI3K-Akt、mTOR、VEGF等信号通路。分子对接验证表明异鼠李素、野漆树苷、异野漆树苷与核心靶点PI3K、AKT1、VEGFA、mTOR、AMPK对接良好,其结合能均≤-20.9 kJ/mol。细胞实验验证发现,异鼠李素可以显著提高HepG2细胞IR模型葡萄糖消耗量(P<0.01),使PI3K、AKT1蛋白表达水平升高,VEGF、mTOR蛋白表达水平降低。研究结果对了解药用与食用黄精次生代谢产物差异、完善黄精品质评价方法以及改善IR潜在活性成分的筛选具有重要的意义。     

黄鳝骨硫酸软骨素提取纯化的初步研究

在稀碱-酶解提取基础上,辅以超声波破碎从黄鳝（Monopterus albus）骨中提取硫酸软骨素（Chondroitin Sulfate,CHS）。比较了三氯乙酸（TCA）法、Sevag法和等电点法除蛋白的效果,并进行了多糖的乙醇分级沉淀实验;粗品经离子交换树脂（CM22）和透析膜（3500Da）透析进一步分离纯化。研究结果表明酶解后用TCA法除蛋白效果好,再加入除蛋白液2倍体积95％乙醇可使大部分CHS沉淀析出;精制品经鉴定含有硫酸基,CHS含量达92．31％;琼脂糖凝胶电泳和红外吸收光谱结果显示精制品与标准CHS相似,初步确定提取物为CHS类多糖。     

冬眠调节机制或可治疗胰岛素抵抗

储脂类冬眠动物在每年夏季大量进食以储存脂肪,在冬季通过冬眠降低代谢并缓慢消耗脂肪。冬眠动物在育肥晚期或冬眠早期表现出高血糖及胰岛素抵抗等症状,但在冬眠结束后胰岛素敏感性明显增强。冬眠可改善胰岛素抵抗症状,这可能是通过改变Akt信号转导通路、葡萄糖转运蛋白(GLUT)和PPARγ/PGC-1α转录复合体的表达来实现的。在肥胖及相关代谢疾病迅速增长的今天,深入研究冬眠动物改善胰岛素抵抗症状的调控机制,可为治疗肥胖病人的胰岛素抵抗提供新的途径。     

明日叶查尔酮对2型糖尿病大鼠骨骼肌细胞胰岛素抵抗的干预作用

目的:研究明日叶查尔酮对2型糖尿病大鼠骨骼肌胰岛素抵抗的干预作用.方法:将2型糖尿病大鼠随机分成四组,高、中、低剂量组分别每日经口灌胃给予明日叶查尔酮30、10和5mg/(kg·bw),糖尿病对照组给予等量生理盐水.各组均以高脂饲料喂养.四周后采用葡萄糖氧化酶法检测空腹血糖;放射免疫法检测血清胰岛素含量;免疫组化法检测葡萄糖转运体1和葡萄糖转运体4蛋白表达水平.结果:经图像分析,高剂量组骨骼肌细胞中葡萄糖转运体1和葡萄糖转运体4蛋白表达平均光密度值分别为0.054± 0.0064和0.063±0.0139,均较糖尿病对照组显著性升高(P＜0.05).高剂量组空腹血糖和胰岛素水平分别为(12.3± 1.64)mmol/L和(25.65±3.34) (μIU/mL),均较糖尿病对照病显著性降低(P＜0.05).结论:明日叶查尔酮可增加2型糖尿病大鼠骨骼肌葡萄糖转运体l和葡萄糖转运体4蛋白表达水平,降低空腹血糖和胰岛素水平,改善胰岛素抵抗状况.     

猴头多糖分离纯化的初步研究

目的：确定适合于猴头多糖分离纯化的方法。方法：以液体发酵生产的猴头菌丝为材料,提取猴头菌丝多糖进行分离纯化,以得到多糖纯品。结果：猴头菌丝粗多糖采用Sevag法除蛋白的次数应该控制在5-8次,而且Sevag法除蛋白所得的HMP,经DEAE-纤维素柱层析初步纯化,多糖主要分布在蒸馏水洗脱部分,命名为HMPⅠ,其含量为67.5%;HMPⅠ经Sephadex G-100凝胶柱层析纯化,得到两个组分：HMPⅠa、HMPⅠb;HMPⅠa为多糖主要组分,含量为71.8%;HMPⅠa经纯度鉴定为多糖纯品。结论：DEAE-纤维素柱层析结合Sephadex G-100凝胶柱层析的纯化方法,可以获得猴头多糖纯品。     

酵母肽体重控制代餐粉调节糖脂代谢功能评价

目的：评价酵母肽体重控制代餐粉对于调节糖脂代谢的作用。方法：用酵母肽以及多种谷物粉配制体重控制代餐粉,采用体外消化的方法测定其GI值。提取得代餐粉水提物,得率为42.97%。将所得的水提物作用于游离脂肪酸诱导的胰岛素抵抗HepG2细胞,采用MTT实验检测其对细胞的毒性,观察HepG2细胞上清葡萄糖、胞内糖原、胞内TG、胞内TC以及油红O染色的变化情况。结果：代餐粉的血糖生成指数（Glycemic Index,GI）为44.23,为低GI食品;其水提物在100~500μg/mL时对细胞的增殖没有影响;与对照组相比,模型组细胞内糖原的含量显著降低,上清葡萄糖,胞内TG、TC的含量均显著升高,代餐粉处理后胞内糖原的含量明显上升,上清葡萄糖,胞内TG、TC的含量均显著下降;油红O染色结果说明,模型组细胞内出现了大量小油滴,说明模型组出现脂代谢异常,而二甲双胍和代餐粉处理后,红色区域明显减少,且500μg/mL代餐粉处理组效果优于300μg/mL。结论：酵母肽体重控制代餐粉可以减缓葡萄糖的释放,调节HepG2细胞的糖脂代谢,减轻HepG2胰岛素抵抗。