大肠杆菌Na+/H+反向运输体A基因的克隆及序列分析

为研究细菌的耐盐机理,根据细菌中存在的Na^ ／H^ 反向运输体(nhaA)的基因序列,采用PCR扩增的方法,从大肠杆菌(Escherichia coli)DHSα中克隆获得了1．1kb的DNA片段,经过核酸序列分析,发现基因片段包含了nhaA基因完整的读码框架。采用序列同源性分析方法,结果显示nhaA基因在多种细菌中均存在,表明nhaA基因是细菌中普遍存在的一种能够反向运输Na^ 的基因,与细菌的耐盐性有着密切的关系,在转基因提高生物耐盐性方面具有主要的应用价值。     

大肠杆菌Na+/H+反向运输体A基因的克隆及序列分析*

为研究细菌的耐盐机理 ,根据细菌中存在的Na⁺/H⁺反向运输体 (nhaA)的基因序列 ,采用PCR扩增的方法 ,从大肠杆菌 (Escherichiacoli)DH5α中克隆获得了11kb的DNA片段 ,经过核酸序列分析 ,发现基因片段包含了nhaA基因完整的读码框架。采用序列同源性分析方法 ,结果显示nhaA基因在多种细菌中均存在 ,表明nhaA基因是细菌中普遍存在的一种能够反向运输Na^{+相似文献}   

油桐尺蠖核型多角体病毒DNA聚合酶基因的克隆和序列分析

用PCR方法从油桐尺蠖核型多角体病毒(BusuNPV)中扩增出DNA聚合酶基因片段,经pGEM-T载体克隆到大肠杆菌DH5α菌株中。经自动序列分析仪测出DNA聚合酶基因2379bp长的核苷酸序列,推导出793的氨基酸序列。氨基酸同源性比较显示,BusuNPV与HzSNPV的同源性最高,达57%;与OpMNPV的同源性最低,为39.6%。     

油桐尺蠖核型多角体病毒DNA聚合酶基因的克隆和序列分析

用PCR方法从油桐尺蠖核型多角体病毒 (BusuNPV)中扩增出DNA聚合酶基因片段 ,经pGEM T载体克隆到大肠杆菌DH5α菌株中。经自动序列分析仪测出DNA聚合酶基因 2 379bp长的核苷酸序列 ,推导出 793的氨基酸序列。氨基酸同源性比较显示 ,BusuNPV与HzSNPV的同源性最高 ,达 57% ;与OpMNPV的同源性最低 ,为 39.6 %。     

RLM-RACE法扩增獐茅液泡膜Na^＋/H^＋逆向转运蛋白基因5′-cDNA末端序列

根据已获得的盐生植物獐茅（Aeluropus littoralisvar.sinensisDebeaux）液泡膜Na^＋/H^＋逆向转运蛋白（Na＋/H＋antiporter）基因部分cDNA片段,设计2条特异引物（GSP1、GSP2）,采用RLM-RACE（RNA ligase-medi-ated rapid amplification of 5′and 3′cDNA ends）法获得了其5-′cDNA末端序列,并找出了转录起始位点。该片段长816 bp,与芦苇液泡膜Na^＋/H^＋逆向转运蛋白基因序列同源性最高达91%,与拟南芥、盐角草、水稻、大麦、小麦的同源性分别为81%、82%、86%、87%和81%,为该基因全长的克隆及启动子的研究奠定了基础。与其它测定基因转录起始位点的方法相比,RLM-RACE方法更快捷、简便、准确。     

HCVNS3基因片段酵母展示文库的构建和鉴定

 HCV NS3特异的 CD4+T细胞反应与 HCV感染的良性转归相关 .为了筛选其 CD4+T细胞表位 ,构建了 HCV NS3基因片段酵母展示文库 .首先 DNase 不完全酶切 HCV NS3基因产生长度为 1 0 0～ 30 0 bp的随机片段 ,然后在它们两端加上含限制性内切酶 Bam H 作用位点的接头 ,再以接头序列作引物进行 PCR扩增 .最后扩增产物用 Bam H 酶切后与 Bam H 线性化的穿梭载体 p YD1连接 ,转化大肠杆菌 (E.coli) DH5α,共得到 2× 1 0 6个转化子 .转化菌落的 PCR扩增结果表明 ,约 50 %转化子含插入片段 .随机选择 5个插入片段测序 ,然后与 DNA序列数据库中的序列比较 .结果显示它们分别与 HCV NS3序列有 96%～ 99%的同源性 .用从转化菌落中提取的质粒转化酵母 (S.cerevisiae)菌株 EBY1 0 0 ,得到含 2× 1 0 5个插入片段的 HCV NS3基因片段酵母展示文库 .半乳糖诱导的酵母细胞通过和 FITC标记的抗体结合 ,用 FACS可以在 2 0 %的细胞表面检测到融合蛋白的表达 .     

β2-肾上腺素能受体基因的克隆及序列分析

目的:克隆β2-肾上腺素能受体(β2-AR)全长基因片段.方法:根据GenBank中收录的猪β2-AR cDNA序列设计一对引物,以猪肝脏组织总RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增目的基因,将其与pUC18载体体外连接,转化感受态大肠杆菌E.coil DH5α,筛选阳性克隆.结果:扩增出一条1257 bp的目的基因片段,该片段编码418个氨基酸.与CenBank中收录的猪β2-AR序列比对,其同源性为99.52%,编码的氨基酸有99.04%相同.结论:成功获得了β2-AR全长基因片段,为该基因的表达和受体筛药模型的建立奠定基础.     

枯草芽孢杆菌渗透压调节基因proB的克隆和表达

用PCR扩增的方法从耐盐的枯草杆菌中克隆出一个13kb长的DNA片段,经功能检测,证明正向插入片段与大肠杆菌的脯氨酸营养缺陷特性(proB-)能够营养互补。含有该重组质粒的大肠杆菌DH5α在基本培养基上的耐盐能力从2%提高至4%。通过引物步行法测定了该插入片段的核苷酸序列。利用DNAsis软件进行序列分析发现,该片段第122～1235bp核苷酸编码一个由370个氨基酸组成的蛋白质分子,其上游存在非典型的-10区,典型的-35区和核糖体结合位点,起始密码子处有最佳翻译起始效率的侧翼核苷酸序列。将其与Genebank中的已知基因的序列和编码的氨基酸序列进行同源性比较,结果表明该片段与枯草杆菌168的核苷酸序列、氨基酸序列的同源性分别为81%和90%。证明该基因确实是一个proB基因。通过与三十个不同种属微芽生物proB基因的氨基酸序列比较,发现该蛋白存在有可能与形成酶的活性中心和三维结构有密切关系的几个绝对保守的区域。     

枳壳CBF转录激活因子基因片段的克隆

根据不同植物CBF同源基因的保守区设计合成简并引物,采用PCR技术首次从枳壳基因组中分离出一个DNA片段并克隆到pMD18-T载体中.序列测定和分析表明,该片段长464bp,与拟南芥3个CBF基因的核酸序列及其推导的氨基酸序列分别具有79%和67%～69%的同源性,而且推导的氨基酸序列含有同源性更高的AP2DNA结合域和CBF蛋白的两段特征序列PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR.结果 表明,本研究克隆的片段为枳壳CBF基因片段.     

酿酒酵母HAL1基因的克隆及植物表达载体的构建

HAL1基因是酵母中重要的耐盐基因。以酿酒酵母AS2.375菌株的DNA为模板,根据已发表的序列设计引物,经PCR扩增得到约900 bp的HAL1基因片段,连接到pMD18-T载体上,转化大肠杆菌JM109,筛选重组质粒进行酶切分析和序列测定,结果显示已克隆到完整的可读框,该基因的序列与已知序列同源性达99%。将HAL1基因从T-载体上切下连接到pAM194载体上构建了HAL 1基因的植物表达载体,用于烟草的转化获得了耐盐性提高的转化植株。     

一个小麦低分子量谷蛋白基因的分离

以新疆小麦日喀则基因组DNA为模板,采用Glu-D3位点特异引物进行PCR扩增。PCR产物插入pUCm-T载体,转化感受态大肠杆菌E．coli DH5a,获得阳性克隆。经测序发现该插入片段长度1287bp,包括了部分启动子序列和完整的编码序列。编码序列推导的蛋白质含有8个半胱氨酸残基,属于6类LMW-GS中的TypeI类,为以后这类基因的功能研究提供了基因材料。     

不同葡萄品种CBF1基因的克隆及序列分析

根据欧洲葡萄CBF1基因序列设计1对特异引物,采用PCR方法从山葡萄、贝达、SO4、Ln33和黑比诺的基因组中各扩增出1个DNA片段并克隆到pMD18-T栽体中.经序列测定和分析,各片段均长756 bp,与欧洲葡萄CBF1基因的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列分别具有98％和99％的同源性,而且推导的氨基酸序列中包含有同源性更高的AP2/EREBP DNA结合域,以及CBFs蛋白的两段特征序列(PKK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR).结果表明从5种葡萄中均可以克隆出CBF1基因.     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌apxIA基因在大肠杆菌中的融合表达与纯化

选取猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)apx1A基因序列中的抗原决定簇集中的区域,采用PCR方法从APP血清1型参考株259的基因组DNA中,扩增apxIA基因中约954 bp的片段,连接到pMD-18T载体,经测序正确后,以EcoR I和Not I双酶切,亚克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌DH5α,经0.4 mmol/L IPTG诱导表达,产物通过尿素变性复性,并以Glutathione Sepharose 4B亲和层析的方法对目的蛋白进一步纯化.SDS-PAGE分析结果显示,目的基因在大肠杆菌DH5ct中以包涵体形式高效表达,经薄层凝胶扫描分析占菌体总蛋白的32%,纯化后的GST融合蛋白纯度达到95%,为亚单位疫苗和诊断抗原的研究奠定了基础.     

杨树叶绿体3′rps12基因,rps7基因和ndhB基因片段的克隆及序列分析

通过烟草叶绿体相关序列设计引物 ,从杨树的叶绿体基因组中克隆出 2个相邻的DNA片段 .经分析发现 ,这 2个DNA片段包含核糖体蛋白 3′rps12、rps7基因和NADH脱氢酶第二亚基ndhB基因片段 .利用DNAMAN等软件 ,将扩增到的杨树叶绿体DNA片段与烟草、拟南芥、玉米和黑松的相关序列进行比较 ,证实所扩增的片段具有较高的保守性 ,尤其是在这 3个基因的编码区 ,同源性均在 90 %以上 .插入或缺失常发生在基因间隔区 ,同源性在 80 %左右 ;对其编码区所推导的氨基酸序列进行了比较 ,同源性均在 92 %以上 .首次克隆了杨树叶绿体的部分DNA序列 ,详细报道并分析了杨树 3′rps12、rps7基因和ndhB基因片段及其边界序列信息 .所报告的基因序列均已登录GenBank .     

蒙古冰草Actin基因片段的克隆及序列分析

旨在利用同源序列法分离蒙古冰草(Agropyron mongolicum Keng)Actin基因同源片段,为研究其他基因在蒙古冰草中的表达和调控提供内标参照.根据禾本科植物小麦Actin基因(AB181991)的保守序列设计2对引物A4和A5,采用RT-PCR扩增蒙古冰草的Actin基因片段,分别得到656 bp和848 bp的片段,使用DNAman和DNAuser等分子生物学软件进行序列分析,将2个片段的重复序列合并后获得一段长度为962 bp的基因片段,编码237个氨基酸,将克隆的Actin基因片段命名为MwACT.该序列与其它植物Actin基因核苷酸序列的同源性均在80%以上,其中与小麦、大麦的同源性达到94%;与氨基酸序列的同源性均在90%以上.     

厌氧菌株Clostridium sp.WGC702的筛选及其β-葡萄糖苷酶基因的克隆

从沼气池中筛选一株产β-葡萄糖苷酶的厌氧菌菌株WGCT02,基于16S rDNA序列及生理特性将其确定为梭菌属,命名为Clostridium sp.WGC702.用Bam HI不完全酶切WGC702的总DNA,回收2～10 kb范围内的DNA片段,连接到pGEM-3zf(+)载体上,电转化至大肠杆菌E.coli DH5...     

SPF鸡胚中内源性白血病病毒全基因序列鉴定与分析

摘要:以国内某3家SPF鸡场的SPF鸡胚成纤维细胞提取的基因组DNA为模板,参照已发表的序列,设计合成了4对检测内源性白血病病毒引物,分别检测gag基因、pol基因、env基因和LTR片段,结果显示4者检出阳性率很高(gag,29/46;pol,27/46;env,24/46;LTR,31/46).设计合成了8对引物,选取4片段检测均为阳性的样品之一,经PCR成功扩增出了8段连续的、相互部分重叠的目的DNA片段,分别连接入T载体进行克隆测序.用DNAstar软件对测序结果进行拼接,从一个鸡胚得到了内源性白血病病毒前病毒全基因组序列.比较分析发现,该序列env基因与已知的E亚群内源性病毒代表株env基因的核苷酸序列同源性在98.5%以上,全基因组序列同源性在99.1%以上,而与其他亚群代表株同源性相对较低,env基因同源性仅为56.3%～91.5%.     

采用RT-PCR扩增方法从犁苞滨藜中扩增NHX基因

采用RT-PCR扩增的方法,从新疆野生植物犁苞滨藜中克隆获得1.7 kb的cDNA片段,测序和序列分析表明该基因片段包含NHX基因完整的读码框架.序列同源性分析结果显示犁苞滨藜NHX基因与滨藜NHX基因同源性高达95%,与碱蓬同源性达到86%,与柑桔同源性为88%,与拟南芥同源性为84%,表明它是植物中高度保守的一种基因,同时说明野生植物犁苞滨藜中也存在与拟南芥相似的植物耐盐相关基因.     

ZFX基因同源序列在黄鳝基因组中的检出及其染色体定位

以大熊猫锌指蛋白基因Zfx为探针 ,在黄鳝基因组DNA中检测到一条长约 9 5kb的杂交带。依据哺乳类和爬行类动物锌指蛋白基因 (ZFX/Zfc)编码第 7～ 13个锌指结构的DNA序列保守性设计引物 ,在黄鳝基因组DNA中仅扩增到一条 5 12bp的DNA片段。将此片段克隆至载体 pBS中 ,从雌性、雄性个体中分别挑选 4个含有插入片段的白色克隆进行测序。测序结果表明 ,这些克隆中插入片段的核苷酸序列一致。该DNA片段在核苷酸水平上与人类ZFX和ZFY分别具有 88%和 87%同源性 ,但其与美洲鳄鱼Zfc的同源性可达 90 % ,而在氨基酸水平上则分别存在 95 9%、95 9%和 93 5 %的同源性 (170个氨基酸 )。该基因命名为黄鳝锌指蛋白基因Zfa ,并运用FISH将其定位于黄鳝 1号染色体 ,距离着丝粒的相对位置为 6 0 1± 0 38。通过进一步研究证明 ,黄鳝 1号染色体上存在有真兽类哺乳动物X染色质同源的保守片段 ,该保守片段有可能就是哺乳动物X染色体起源和进化的原始物质基础之一。应用哺乳动物X染色体连锁的其他基因在鱼类开展染色体比较定位研究 ,将有望促进脊椎动物性染色体进化的深入研究     

近平滑念珠菌ERG 11基因编码区的克隆及生物信息学分析

目的克隆、测序近平滑念珠菌ERG11基因的编码区序列并进行生物信息学分析。方法运用生物信息学的方法 ,通过与白念珠菌ERG11基因碱基序列同源性比对,在近平滑念珠菌基因组(www.sanger.ac.uk/sequencing/Candida/pa-rapsilosis/)中寻找可能的ERG11基因序列(CpERG11),并据此序列设计引物,经PCR扩增近平滑念珠菌标准株(ATCC22019)的ERG11基因片段,产物经电泳、纯化、克隆到质粒prG-AMAI-NotI中,转染DH10B大肠杆菌细胞,并酶切鉴定筛选阳性克隆测序分析。结果近平滑念珠菌ERG11编码区由1569个碱基组成,编码一段含522个氨基酸的多肽。近平滑念珠菌ERG11的编码区序列与白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、酿酒酵母菌ERG11基因的同源性分别为74%、75%、65%、64%。该近平滑念珠菌ERG11的编码区为唑类药物作用靶酶基因。结论成功克隆、测序、并生物信息学分析近平滑念珠菌ERG11基因的编码区序列,为进一步的功能研究奠定基础。