传代细胞与疫苗生产

<正>五六十年代疫苗生产规程明确规定,凡在传代细胞(下称CCL)上传代过的病毒不可作生产毒种。理由是CCL能在体外无限传代,已不属于正常细胞。但近12年来,情况发生了根本的变化,不仅已批准用于生产灭活脊灰及狂犬疫苗,而且已用于生产活疫苗。发生这一转变的原因,可归纳以下三方面:     

4种疫苗脂质体合成方法的研究

目前在国内将脂质体用于疫苗的领域尚未见报道。我们摸索了不同的脂质体合成技术,制备合适的脂质体包被甲肝减毒活疫苗,重组乙肝疫苗、白喉类毒素和破伤风类毒素,开发脂质体疫苗的合成途径,以根据不同疫苗的特点和免疫途径生产相应的脂质体疫苗。1材料与方法1．1材料磷脂酸胆碱（Phoophatidvlserline,PC）,磷脂酸丝氨酸（Phesphatidylserline,PS）,Choesteral（CH）均为西格玛公司产品。甲肝减毒活疫苗,CHO细胞重组乙肝疫苗,破伤风类毒素,白喉类毒素为我所生产的半成品,各项检定指标均合格。1．2方法脂质体粒径和粒度分布…     

用化学试剂灭活时病毒悬液感染性测定的一些特点

<正>病毒感染性灭活和在制备死疫苗时灭活控制的首要条件就是要有一适当的方法来测定灭活过程中病毒材料的感染性。对于动物病毒,广泛使用鸡胚的滴定方法。 结果可用Reed和Muench的方法测算。该法是将每一稀释度的病毒材料接种若干个鸡胚并记录感染鸡胚的数量。随着稀释度增加,受感染的鸡胚数量在一定稀释度时开始减少。从而可以计算出原始材料中病毒的滴度。     

重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)生产工艺病毒灭活验证

目的:验证重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)生产工艺灭活病毒能力,评价疫苗安全性。方法:将乙型肝炎疫苗原液按1∶9比例加入指示病毒(麻疹病毒、VSV病毒),混匀后加入甲醛溶液,使甲醛终浓度达到1/2000和1/4000,放置于37℃,分别于0h、24h、48h、72h取样,用亚硫酸氢钠中和,贮存于-70℃待检或立即检测病毒滴度,对病毒检测阴性的样品盲传3代,进一步检测。结果:疫苗原液加入1/2000和1/4000的甲醛溶液,37℃作用24h、48h、72h,麻疹病毒滴度下降4.0个Log值,VSV病毒滴度下降5.0个Log值,且细胞盲传三代,均未出现细胞病变。结论:乙型肝炎疫苗原液在1/2000和1/4000甲醛浓度37℃72h作用下,均能有效灭活麻疹病毒和VSV病毒。     

防治和根除狂犬病的新途径

灭活的完整狂犬病毒(RV)颗粒是最安全和最有效的抗原,适合用作狂犬病的免疫治疗;灭活RV疫苗,例如HDCV疫苗,仍然是金标准。但是若干种正在研究的实验性疫苗(如以G蛋白为基础的DNA和重组疫苗),也有可能替代灭活病毒。为了达到可与金标准疫苗相当的效力,在这些新型疫苗中的G蛋白必须以与在完整病毒颗粒中相似的方式出现,即是锚定在膜上并有很高的密度。     

利用鸭乙型肝炎病毒感染模型评价血液成分中病毒的灭活效果

目的 利用鸭乙型肝炎病毒(DHBV)感染动物模型,评价亚甲蓝光化学病毒灭活方法对血液成分中DNA病毒的灭活效果。方法 将超离纯化的DHBV分别加入人血浆或人红细胞,经亚甲蓝光化学灭活病毒,将含不同基因组拷贝数DHBV的血浆成分经静脉感染1 d龄雏鸭。采用放射性核素核酸杂交法对血清中DHBV DNA进行检测,计算病毒灭活处理前、后人血浆及人红细胞中DHBV的半数感染计量(ID50)。结果 结果显示加入DHBV的血浆在未经灭活处理前对1 d龄雏鸭的ID50值为103.33,而经病毒灭活处理后ID50值为1010拷贝,灭活处理可使病毒感染性滴度下降达6个Log;加入DHBV的红细胞灭活前ID50值为103.35,经灭活处理后ID50值为108.35拷贝,灭活处理使病毒感染性滴度下降5个Log。结论 利用DHBV感染动物模型,可以检测到少量病毒在自然感染宿主体内的感染性,可用于评判血液成分中病毒灭活方法的效果,亚甲蓝光化学处理对血浆中DNA病毒的灭活效果较好于对红细胞中DNA病毒的灭活作用。     

水体病毒浓缩条件的优化

病毒浓缩条件的优化是水环境病毒污染监测及灭活去除效率评价的基础,本文开发了在待浓缩水样中预先加入钠化蒙脱石吸附病毒以增加其沉降性能,并在优化絮凝条件下用聚合氯化铝絮凝沉淀蒙脱石钠的水体病毒浓缩方法.该方法对人为污染的脊髓灰质炎病毒(Poliovirus 1, PV1)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)、大肠杆菌噬菌体(Phage of Ecoli, E.cp)在闽江水、生活污水、自来水中分别有高于84.3%的浓缩回收率,说明该浓缩方法具有较广泛的适用性和应用前景,可为水体病毒污染监测及灭活去除评价提供一个简便、回收率高、成本低的浓缩方法.     

口蹄疫新型疫苗研究进展

口蹄疫(FMD)是一种严重威胁畜牧业发展的重要传染病,目前世界上许多国家和地区都有该病的流行与发生.其控制措施主要是疫苗免疫,虽然传统疫苗在该病的防控中起了重要的作用,但也存在着诸多的缺点.因此研制新型的FMD疫苗是今后的发展方向.本文结合实验室在FMD新型疫苗研究方面所开展的探索性研究工作,综述了国内外在FMD基因工程弱毒苗或灭活苗、蛋白质和合成肽疫苗、空衣壳疫苗、细胞因子增强型疫苗等研究领域所取得的进展.     

冻干人用狂犬病纯化疫苗的研制

在以原代地鼠肾细胞培养生产狂犬病疫苗工艺的基础上,通过对病毒收获液的浓缩倍数、灭活方式的改进及优化、冻干稳定剂的筛选、冻干曲线的确立,制备出了冻干疫苗,其质量及稳定性较液体疫苗有了整体水平的提高,各项检定结果均符合《中国生物制品规程》(2000版)。     

精制原代地鼠肾细胞狂犬病疫苗制备工艺的研究

通过ａＧ 株病毒在金黄地鼠肾细胞中培养,而制备的一种新型灭活狂犬病精制疫苗已获成功。该纯化方法包括醋酸锌沉淀和Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦ柱层析,所生产的疫苗质量完全达到新型狂犬病疫苗的要求。该工艺方法简单,成本低廉,是一种理想的狂犬病疫苗生产方法。     

低pH孵放法灭活静注人免疫球蛋白中脂包膜病毒效果验证的研究

选用不同核酸类型的脂包膜病毒,其中RNA病毒为水疱性口炎病毒(VSV),DNA病毒为伪狂犬病毒(PRV),将两种指示病毒分别用于验证低pH孵放法对不同厂家生产的人血静脉注射用丙种球蛋白(IVIG)的病毒灭活效果。结果表明,液体IVIG的pH值为3.8～4.4,在23～25℃环境中,孵放21天可灭活VSV和PRV,两种指示病毒的灭活效果分别为≥5.50～6.62和≥5.38～6.62logTCID50/0.1ml。因此,低pH孵放法是一种安全、有效且简便实用的灭活脂包膜病毒的方法。     

辛酸盐灭活静注人免疫球蛋白中脂包膜病毒效果验证的研究

选用不同核酸类型的脂包膜病毒,其中RNA病毒为水疱性口炎病毒(VSV),DNA病毒为伪狂犬病毒(PRV),将两种指示病毒分别用于验证一定浓度的辛酸盐对某一厂家生产的人血静脉注射用丙种球蛋白(IVIG)的病毒灭活效果。结果表明,液体IVIG在辛酸钠(0.7±0.2mmol/g蛋白)、pH(5.1±0.1)、29.5~30.5℃,孵放90min可灭活VSV和PRV,两种指示病毒的灭活效果分别为≥4.00~4.12和≥5.25~5.75log TCID50/0.1ml。因此,辛酸盐是一种安全、有效、快速的灭活脂包膜病毒的灭活剂。     

精制Vero细胞狂犬病疫苗的灭活和纯化

通过狂犬病病毒灭活和纯化试验,试验精制Vero细胞狂犬病疫苗。疫苗经检测残余小牛血清白蛋白含量,Vero细胞残余DNA含量,疫苗效价,安全试验均能达到WHO规程要求。初步建立了适合大规模生产精制Vero细胞狂犬病疫苗的灭活和纯化工艺。     

表达HIV-1多价合成基因的重组痘苗病毒疫苗株的构建

为研制适合我国使用的HIV疫苗,选择具有代表意义的中国流行株HIV CN54(B′/C)病毒gag、pol、nef等基因的合成基因syngpnef,插入到自行构建的能在病毒筛选过程中将标记基因去除掉的双标记基因痘苗病毒载体pVI75的KpnI酶切位点,构建成转移质粒pVI75-syngpnef,与我国的天坛株痘苗病毒共转染鸡胚成纤维细胞,通过蓝白斑筛选得到的重组病毒疫苗株DNA。经PCR鉴定标记基因已被删除并有目的基因的整合,Western blot可检测到目的基因的融合表达。此重组病毒疫苗株有望成为HIV/AIDS候选疫苗。     

干热法对人血浆血管性假血友病因子冻干品中病毒灭活效果的观察

目的探讨干热灭活法(dry heat treatment)对血管性假血友病因子(von willebrand factor,v WF)中猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)和脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)的灭活效果。方法以PPV或EMCV作为灭活指示病毒与v WF混合,并分别在(80±1)℃4、8、12、24、36、48、72 h,(90±1)℃4、12、24、36、48 h以及(99±1)℃5、15、30 min进行干热灭活处理。将在干热灭活前以及干热灭活后不同温度时间段的v WF样品接种ST细胞(swine testis)或Vero细胞培养,观察细胞病变(cytopathic effect,CPE),用Reed-Muench法计算残余PPV和EMCV的病毒滴度。对无CPE的样品进行盲传3代培养,验证其灭活效果,并检测干热处理前后的v WF活性。结果v WF中EMCV滴度在(80±1)℃、(90±1)℃以及(99±1)℃灭活条件下,均下降超过4.0 lg TCID_(50)/0.1 m L,v WF中PPV的滴度下降也均超过4.0 lg TCID_(50)/0.1m L。干热法灭活后v WF的活性下降20%,质量稳定。结论干热法可以灭活v WF中的PPV以及EMCV,且对样品的活性影响在允许范围之内。     

流行性感冒病毒灭活疫苗规模化生产工艺的建立

本文报告了流行性感冒病毒疫苗规模化生产工艺的建立及结果,用鸡胚分别接种A1,A3,和B型病毒株,培养后进行了纯化,配苗及检定,对培养时间,收获量、离心分离及纯化、灭活、脱糖等重要步骤进行了优化比较。结果表明,培养66小时病毒滴度及收获量达到最高;采用蔗糖密度梯度离心可收到理想的分离效果;超滤脱糖优于透析法;β-丙内酯在生产中是一种理想的灭活剂,并依此筛选出最优化工艺配置,建立了切实可行的疫苗规模生产工艺,成功制备了质量稳定,安全可靠的疫苗制剂。     

经有机溶剂/表面活性剂处理的人血浆的生产和体外特性

<正>本文叙述了使用改良的TNBP/表面活性剂处理的冻干和冷冻人血浆的生产以及这种病毒灭活血浆的体外特性。 材料与方法 人血浆处理和病毒灭活 用于生产冻干的经过S/D处理的和冰冻的血浆分别来自瑞士Octapharma公司和德国Hagen红十字中心。 贮存于-30℃以下的同种血型的250份新鲜冰冻血浆(每份200～250ml)在不锈钢容器中,30℃条件下融化,经确定是溶血或脂血的血浆在混合和     

S／D法处理凝血因子浓缩物类制品的病毒灭活验证

以水泡性口炎病毒 (VSV)为指示病毒 ,验证应用有机溶剂 /去污剂 (简称S/D)法灭活血液制品中病毒的生产工艺 ,并对不同厂家不同批号的四种凝血因子浓缩物类制品 (中间品 )的病毒灭活效果进行了分析总结。结果表明当制品中TNBP和Tween80终浓度为 0 3%和 1 0 % ,在 2 5± 1℃处理 6小时后对于包膜病毒确有显著的灭活效果。     

微载体灌注培养制备Vero细胞狂犬病疫苗

本文研究在生物反应器中用微载体连续灌注培养Vero细胞生产狂犬病毒制备技术.在5L体积的生物反应器中,加入含10g/L微载体的199培养基,接种Vero细胞至细胞浓度达到1×105/mL,培养7d后细胞可生长至6～7×106/mL,然后以感染复数(MOI)为0.01接种狂犬病毒VaG株,接毒后24h开始收获,连续收获12d左右,收获的病毒滴度范围在6.0～8.5log LD50/mL,收获的病毒原液经浓缩、灭活和纯化等步骤制备成疫苗,各项质量指标均达到<中国生物制品规程>2000年版要求.实验表明,用生物反应器微载体灌注培养制备人用Vero细胞狂犬病疫苗小试工艺可行.     

腮腺炎病毒三种实验室常规灭活方法效果评价

探究几种实验室常规消毒灭活方法对腮腺炎病毒的灭活效果,为实验室进行腮腺炎病毒消毒工作提供基础数据。本研究采用热灭活、紫外线灭活和化学试剂灭活三种方法对腮腺炎病毒进行灭活处理,灭活处理后腮腺炎病毒采用细胞培养技术进行病毒滴定,评估上述灭活方法对腮腺炎病毒的灭活效果。热灭活方法显示,腮腺炎病毒对热敏感,随温度升高和热灭活时间增长对腮腺炎病毒灭活有明显加强作用。65℃30min、60min和70℃10min、30min、60min可有效灭活腮腺炎病毒;紫外线灭活方法显示,紫外线照射15min,30min,60min均可有效灭活涂抹在平皿表面的腮腺炎病毒,但对毒株液倾倒导致的MuV液体不能达到完全灭活效果;化学试剂灭活方法显示,三氯异氰泡腾片、1%过氧化氢、3%过氧化氢和75%乙醇根据试剂说明书处理后病毒均能有效灭活腮腺炎病毒。三种灭活方法在一定条件下均能实现对腮腺炎病毒的灭活,可以作为实验室常规灭活腮腺炎病毒方法。建议使用65℃30min或70℃10min对腮腺炎病毒进行有效灭活。紫外线适用于对腮腺炎病毒进行表面消毒,但对液滴状病毒污染建议使用化学试剂进行有效灭活。