抗肿瘤血管抗体AA98功能片段VH/κ的脲浓度梯度柱复性

利用稀释法、凝胶过滤、脲浓度梯度凝胶过滤3种方法研究了抗肿瘤血管抗体功能片段VH/κ的体外复性.通过考察复性液中还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)比例、精氨酸浓度、pH值、洗脱速度、变性液中蛋白质浓度、凝胶过滤脲梯度长度等因素,发展了脲梯度凝胶过滤柱复性VH/κ的方法.结果表明,与传统的稀释法和柱复性法相比,脲梯度法复性获得的VH/κ的活性回收率和相对亲和力均有显著提高.     

抗肿瘤血管抗体AA98功能片段VH/κ的脲浓度梯度柱复性

利用稀释法、凝胶过滤、脲浓度梯度凝胶过滤3种方法研究了抗肿瘤血管抗体功能片段V_H/κ的体外复性.通过考察复性液中还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)比例、精氨酸浓度、pH值、洗脱速度、变性液中蛋白质浓度、凝胶过滤脲梯度长度等因素,发展了脲梯度凝胶过滤柱复性V_H/κ的方法.结果表明,与传统的稀释法和柱复性法相比,脲梯度法复性获得的V_H/κ的活性回收率和相对亲和力均有显著提高.     

大肠杆菌表达的单链抗体柱复性的研究

对包含体表达的抗乙肝病毒表面抗原（HBsAg）的单链抗体（ScFv）纯化复性进行了探索.尝试了利用金属螯合亲和层析和凝胶层析柱进行柱上在位复性的可行性. 对包含体表达的ScFv进行透析复性与柱复性,比较其相对复性率及蛋白质回收率,发现柱上复性效果优于传统的透析复性.抗HBsAg ScFv经凝胶色谱Sephacyl S-200柱复性的相对复性率为98%, 蛋白质回收率为81%.由于将纯化复性同步进行,简化了操作程序,提高了产品的回收率.     

大肠杆菌表达的单链抗体柱复性的研究

对包含体表达的抗乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的单链抗体(ScFv)纯化复性进行了探索.尝试了利用金属螯合亲和层析和凝胶层析柱进行柱上在位复性的可行性. 对包含体表达的ScFv进行透析复性与柱复性,比较其相对复性率及蛋白质回收率,发现柱上复性效果优于传统的透析复性.抗HBsAg ScFv经凝胶色谱Sephacyl S-200柱复性的相对复性率为98%, 蛋白质回收率为81%.由于将纯化复性同步进行,简化了操作程序,提高了产品的回收率.     

重组羧肽酶原B的复性方法研究

构建的羧肽酶原B表达质粒在大肠杆菌中获得高表达。但目的蛋白是以包涵体的形式存在。为了获得活性羧肽酶B,必须对其包涵体进行变复性。首先利用稀释复性确定了羧肽酶原B复性的最佳缓冲液;在凝胶过滤复性中,研究了柱长和洗脱流速对羧肽酶原B复性效率的影响;另外对比了稀释复性、透析复性、凝胶层析复性和Ni2 亲合层析法等四种方法对羧肽酶原B的复性效果。结果发现,这4种方法的复性效果有以下顺序:凝胶过滤复性>稀释复性>Ni2 亲合层析>透析复性。     

RGD-葡激酶的凝胶过滤层析法复性及其纯化

构建的溶栓和抗栓双重功能的RGD-葡激酶突变体(RGD-Sak)在大肠杆菌中高表达,目的蛋白质以包涵体形式存在。为获得有活性的蛋白质,需要对包涵体进行变复性。利用凝胶层析方法对包涵体中RGD-Sak进行复性,并与稀释复性法进行比较,发现凝胶柱复性方法具有操作周期短、简便、成本低而高效等优点。复性后蛋白质用Q-Sepharose FF离子交换进一步纯化,纯度达95%,酪蛋白凝胶板活性测定表明两种复性法得到的蛋白质比活性相当。圆二色谱测定显示两种复性法得到的蛋白质的二级结构成份和谱形一致,说明在两种复性过程中完成了RGD-Sak分子的正确折叠。     

重组羧肽酶原B的复性方法研究*

构建的羧肽酶原B表达质粒在大肠杆菌中获得高表达。但目的蛋白是以包涵体的形式存在。为了获得活性羧肽酶B,必须对其包涵体进行变复性。首先利用稀释复性确定了羧肽酶原B复性的最佳缓冲液;在凝胶过滤复性中,研究了柱长和洗脱流速对羧肽酶原B复性效率的影响;另外对比了稀释复性、透析复性、凝胶层析复性和Ni²⁺亲合层析法等四种方法对羧肽酶原B的复性效果。结果发现,这4种方法的复性效果有以下顺序:凝胶过滤复性>稀释复性>Ni²⁺亲合层析>透析复性。     

重组人胰激肽原酶复性工艺的研究

目的:研究重组人胰激肽原酶包涵体变性及复性的工艺。方法:对本实验室构建的重组人胰激肽原酶大肠杆菌进行IPTG诱导表达表达成功后,菌体经超声破碎释放包涵体,包涵体经洗涤、变性、稀释和尿素梯度凝胶过滤色谱这两种方法复性后(Sephadex-G75),通过测定酶活检验复性效果。结果:①重组人胰激肽原酶工程菌经过IPTG诱导后能够表达目的蛋白,目的蛋白以包涵体形式存在,将细胞破碎后,包涵体经过3次洗涤,纯度达到71.93%;②变性包涵体经24小时稀释复性后,蛋白浓度达到72.61μg/m L,酶的比活达到13.84 U/mg;③变性包涵体经过2个小时的尿素梯度凝胶过滤复性后,蛋白浓度可达到830.07μg/mL,酶的比活达到48.61 U/mg。结论:两种复性方法均可以使包涵体达到一定的浓度和比活,比较发现尿素梯度凝胶过滤色谱具有复性时间短和比活力高等优点,可作为重组人胰激肽原酶复性的一种有效的手段。     

蛋白质凝胶过滤色谱上样方法的改进

凝胶过滤色谱因其操作方法简单,重复性强等特点在生物大分子的分离纯化中被广泛使用。特别在基因工程蛋白质类药物的精细纯化中起着难以替代的作用。但由于蛋白质凝胶过滤色谱要求样品上样体积较小及洗脱流速较小时才能获得理想的分辨率,这使得凝胶过滤色谱经常成为蛋白质大规模纯化工艺中的限速步骤。本介绍一种改进的上样方法,在不降低分辨率的前提下,可将单位时间内凝胶过滤柱的产量提高两倍。     

凝胶色谱柱复性在低分子量尿激酶原突变体(DscuPA\|32K)中的应用

将构建的一种具溶栓和抗栓双重功能尿激酶原突变体(DscuPA\|32K)基因,在大肠杆菌中进行表达。由于DscuPA\|32K分子较大并且表达量较高,目的蛋白质基本以包涵体的形式存在。包涵体中的蛋白质是无活性的蛋白质,为了获得有活性的蛋白质,就需要对包涵体进行变性及复性。尝试了一种新的凝胶色谱柱复性方法,并通过柱复性方法与常规的稀释复性方法进行了比较,发现柱复性方法明显优于稀释复性方法,具有成本低,效率高,并对目的蛋白质(DscuPA\|32K)进行了初步纯化等优点,尤其对酶这一类容易失活降解的蛋白质进行复性时,很值得进行推广应用。