肠膜明串珠菌蔗糖磷酸化酶的酶学表征及在催化合成α-熊果苷中的应用

将来源于肠膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides ATCC 12291的蔗糖磷酸化酶(Sucrose phosphorylase,SPase)基因进行密码子优化后将其插入到pET-28a中构建表达载体pET-28a-spase,诱导大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)/pET-28a-spase表达制得SPase粗酶液,将重组SPase纯化后进行酶学表征。结果表明,重组SPase的比酶活为213.98 U/mg,纯化倍数为1.47倍,酶活回收率达87.80%。该酶最适温度为45℃,最适pH为6.5,该酶对蔗糖的Km为128.8 mmol/L,Vmax为2.167μmol/(mL·min),kcat为39 237.86 min-1,利用重组SPase催化氢醌合成α-熊果苷,最优条件为:氢醌添加量为40 g/L,蔗糖/氢醌的摩尔比为5:1,重组SPase 250 U/mL。在25 mmol/L的吗啉乙磺酸(MES)缓冲液(pH 7.0)中,反应温度30℃,避光反应24 h后终止反应,再用500 U/mL的糖化酶40℃处理2.5 h。α-熊果苷产...     

蔗糖磷酸化酶的分离纯化及其催化合成α-熊果苷的研究

考察了肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)G123厌氧发酵产蔗糖磷酸化酶下游的分离纯化工艺.收集的菌体经超声破碎得到粗酶液,通过硫酸铵沉淀、透析、阴离子交换层析分离后获得了电泳纯的蔗糖磷酸化酶,酶活回收率为31.7%,酶的分子量约为55.7 kD,纯化后的蔗糖磷酸化酶比活为115.3 U/mg.该酶在中性及偏酸性(pH5.5-8.0)情况下,酶稳定性较好,较报道的肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)B-1149的pH稳定范围宽.同时该酶在37℃保存2 h,酶活几乎没有下降.利用获得的纯酶以氢醌和蔗糖为底物催化合成α-熊果苷,在23 U/mL的酶反应体系中,60%蔗糖、5%氢醌、pH7.5,37℃,反应12 h,氢醌转化率达到16.3%,α-熊果苷的产量为20g/L.     

蔗糖富集环境中蔗糖磷酸化酶的酶学性质研究与改造

【背景】蔗糖富集土壤是蔗糖磷酸化酶的重要来源之一。此酶能以较廉价的蔗糖为底物进行转葡萄糖基反应,改善受体底物的理化性质,因而具有重要的应用价值。【目的】研究蔗糖富集土壤中蔗糖磷酸化酶的酶学性质和转糖苷活性,为其更优质的改造提供材料和理论基础。【方法】将宏基因组中获得的蔗糖磷酸化酶基因克隆到表达载体上构建重组大肠杆菌,诱导表达并进行镍亲和层析纯化蛋白。以蔗糖为底物测量重组酶的基本酶学性质,研究其对糖类底物的转糖苷活性。通过底物通道分析,利用反向PCR技术对其第155位点进行饱和突变,并测定突变体基本酶学性质和转糖苷活性。【结果】纯化的酶蛋白分子量大小约为56 kD,活性状态时以三聚体形式存在。在以蔗糖为底物时,最适温度和最适pH值分别为55°C和6.5;Km和Vmax值分别为23.1±2.4 mmol/L和407.9±8.5μmol/(mg·min),对第155位点进行了定点饱和突变,获得了部分酶学性质或转糖苷活性改善的突变体。【结论】宏基因组中蔗糖磷酸化酶的研究丰富了酶学数据,并通过分子改造获得了部分性质更优的突变体,为转糖苷活性关键氨基酸的研究和该酶的工业应用奠定了基础。     

重组大肠杆菌右旋糖酐蔗糖酶的纯化及其性质

[目的]研究工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28-dexYG产右旋糖酐蔗糖酶的纯化和酶学性质.[方法]工程菌经过IPTG诱导后生产含His-tag融合蛋白的右旋糖酐蔗糖酶,通过硫酸铵沉淀、Ni-NTA亲和层析纯化,得到纯度较高的酶蛋白,并对纯酶进行了酶学性质及动力学研究.[结果]经过SDS-PAGE测得该酶的分子量约为170 kDa,与理论推测值基本相同.以蔗糖为底物,酶促反应的最适温度为25～30℃,最适pH值为5.4,动力学常数Km值为10.43 mmol/L;酶活在pH 5.0～8.0较为稳定,在室温(25 ℃)保藏4天仍有59%的酶活力,4℃保存7周酶活力仅下降一半,但在35℃以上失活很快;Ca2 对催化作用有较大的促进,Mg2 有微弱的促进作用,K 对催化反应无影响,Cu2 的抑制作用最强.其他试剂对重组酶的活性有不同程度的影响,其中SDS抑制作用很强.[结论]研究为重组右旋糖酐蔗糖酶纯酶的获取、得到稳定性好、活性高的酶反应体系及利用该酶进行催化反应和工业化应用提供了重要参数.     

产α-淀粉酶菌株的分离、鉴定及酶学性质研究

目的:筛选高产α-淀粉酶菌株,为工业生产α-淀粉酶提供储备菌株。方法:利用碘液显色法和摇瓶发酵法,从土壤中筛选产α-淀粉酶菌株;通过菌落形态、菌体特征观察和16S rDNA序列比对对菌种进行鉴定;发酵粗酶液经硫酸铵沉淀、透析脱盐后,对其酶学性质进行初步研究。结果:从土壤中筛选到一株高产α-淀粉酶菌株,枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis XL-15。该菌株所产α-淀粉酶的最适反应温度为50℃,最适作用pH为6.5;Ca2 和Mn2 对酶有激活作用,而Cu2 、Zn2 和EDTA对酶有抑制作用;酶的动力学研究测出米氏常数Km值为1.726mg/mL。结论:该菌株是产α-淀粉酶的较好材料,且具有一定的应用前景。     

一种来源于青霉的新的α-半乳糖苷酶的分离纯化及其酶学性质

从丝状真菌中筛选到一株产α-半乳糖苷酶的菌株F63,对该菌株进行了形态观察和18SrDNA序列分析,该菌株属于青霉属。采用硫酸铵沉淀、阴离子交换层析和分子筛层析等方法分离纯化了该菌株的一种α-半乳糖苷酶。经过聚丙烯酰胺凝胶电泳,此酶蛋白的分子量约为82kDa。该α-半乳糖苷酶反应的最适pH为5.0,最适温度为45℃。此α-半乳糖苷酶的热稳定性在40℃以下,pH稳定性为pH5.0-6.0。与已报道的α-半乳糖苷酶的活性都受到Ag 的强烈抑制不同的是,该α-半乳糖苷酶受Ag 的抑制作用不显著。以pNPG为底物的Km值为1.4mmol/L和Vmax=1.556mmol/L.min-1.mg-1。该酶可以有效降解蜜二糖、棉子糖和水苏糖,但不能降解末端含α-半乳糖苷键的多糖。通过利用质谱技术对纯化的α-半乳糖苷酶进行鉴定以及内肽的N端测序证明该蛋白为一种新的α-半乳糖苷酶。     

黏细菌漆酶序列筛选及其重组酶酶学性质

漆酶是一种应用广泛的绿色环保的多酚氧化酶。漆酶过去被认为广泛存在于植物、昆虫和真菌中,而近年来,越来越多的细菌中也发现了漆酶的存在。黏细菌是一类重要的资源菌,但与一般细菌相比,较难分离和纯化。文中利用生物信息学的方法,综合应用Blast和隐马尔可夫模型方法对黏细菌蛋白质组数据库进行搜索,并根据多铜氧化酶的保守铜离子结合位点进行进一步筛选,获得30个候选黏细菌漆酶序列。挑选其中9个,在大肠杆菌中进行重组表达。利用2,6-甲氧基苯酚(DMP)等常用漆酶底物检测重组酶的催化氧化活性,其中7个重组蛋白具有漆酶催化活性。选择1个对2,6-甲氧基苯酚(DMP)具有较高氧化活性的重组酶(命名为rSC-2),通过Ni-NTA亲和层析柱纯化rSC-2,测试其酶学性质。纯化的rSC-2蛋白分子量约57 kDa,在最适反应条件下,rSC-2催化DMP反应的比酶活为0.27 U/mg。催化DMP反应的最适温度为60℃,最适pH为7.0。rSC-2在pH 7.0-8.0有较高酶活,在60℃孵育1 h保留50%以上剩余酶活。低浓度的Ca~(2+)对酶活有一定的促进作用,而较高浓度的Fe~(3+)、Co~(2+)、Ba~(2+)对酶活的抑制作用较明显。这是首次对黏细菌漆酶序列进行系统性的生物信息学分析,并实现纤维堆囊菌Sorangium cellulosum序列来源的漆酶活性蛋白在大肠杆菌细胞中重组表达。     

酸性α-淀粉酶的分离纯化与酶学性质研究

纯化了枯草芽胞杆菌xm-1菌株酸性α-淀粉酶,并对其酶学性质进行了研究。通过硫酸铵沉淀和Sephadex G-75凝胶层析将酸性α-淀粉酶粗酶液纯化了32.5倍,活力回收率为10.0%。酶性质测定结果表明,该酸性α-淀粉酶分子量约为60kD,最适反应温度为45℃、最适作用pH5.0,该酶在pH3.4-6.0下稳定,高温耐受性差。Cu2+、Zn2+、EDTA对酶有不同程度的抑制作用,Ca2+和Mn2+对酶具有较强的激活作用。     

枯草芽孢杆菌TM903嘌呤核苷磷酸化酶的纯化及酶学性质研究

目的：对枯草芽孢杆菌TM903嘌呤核苷磷酸化酶进行分离纯化及酶学性质研究。方法：经加热、硫酸铵盐析和SephadexG-100凝胶过滤,对枯草芽孢杆菌TM903中的嘌呤核苷磷酸化酶进行分离纯化,并对其酶学性质进行研究。结果：酶的最适反应温度为65℃,最适反应pH值为7．5,在30-50℃时热稳定性较好;K^＋对该酶有激活作用,而Na^＋、ca^＋、Mg^＋、Mn^＋等金属离子对该酶有抑制作用;Km值为2．11mmol／L,Vmax值为0．84mmol／（min·L）。结论：分离纯化了枯草芽孢杆菌TM903嘌呤核苷磷酸化酶,并研究了其酶学性质,为利巴韦林的发酵工艺优化提供了重要的酶学理论基础。     

嗜热厌氧乙醇杆菌α-葡萄糖苷酶基因的表达及酶学性质的研究

用PCR方法从嗜热厌氧乙醇杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)JW200中扩增出编码a-葡萄糖苷酶的基因,将其克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pTrc99A上并获得表达a-葡萄糖苷酶的大肠杆菌重组菌。重组菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测出蛋白相对分子量约89kDa,经阴离子交换层析和凝胶层析纯化后的a-葡萄糖苷酶最适反应温度为70℃,最适反应pH为5～5.5,且在pH 5.5～6.5之间有较高的稳定性。重组a-葡萄糖苷酶在70℃下105 min后酶活仍达到80%。     

嗜麦芽黄单胞菌游离细胞催化合成α-熊果苷

研究了利用嗜麦芽黄单胞菌BT-112(Xanthomonas maltophilia BT-112)游离细胞生物催化合成α-熊果苷,系统探讨了温度、对苯二酚浓度、对苯二酚与蔗糖摩尔比、反应时间、转速、细胞浓度、磷酸缓冲溶液pH值和浓度对反应转化率的影响。最佳反应条件为:反应温度为25℃,菌体对对苯二酚的最大耐受度为30mmol/L,蔗糖和对苯二酚的摩尔比为20∶1,反应时间为45h,摇床转速为160r/min,细胞浓度为85g/L,磷酸缓冲溶液浓度为25mmol/L、pH值为8.0。在此条件下α-熊果苷转化率高达86.7%(以对苯二酚计算)。     

重组大肠杆菌热稳定性过氧化氢酶的纯化及性质研究

将产热稳定性过氧化氢酶的重组大肠杆菌培养后菌体破碎得到的粗酶液经热处理、硫酸铵分级沉淀、DEAE\|Sephadex A\|50离子交换层析、HiPrep16/10 Phenyl疏水作用层析、Superdex200 HR 10/30凝胶层析提纯后得到电泳纯的酶,比酶活达到15629U/mg。此酶的最适温度为70℃,最适pH70,在60℃保温60min酶活力基本不变,在pH3～8的范围内比较稳定。此酶的Km和Vmax分别为775mmol/L和278mmol\5min\+\{-1\}·mg-1。1mmol/L的Zn2+、Ba2+、Mn2+可使该酶完全失活,KCN、NaN\-3、Na\-2S\-2O\-4、巯基乙醇对酶活力有抑制作用,50mmol/L的EDTA不影响酶活性。     

蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶的表面展示及酶学性质分析

【目的】蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶催化1分子蔗糖上的果糖基转移到另一个蔗糖分子上,形成1-蔗果三糖和葡萄糖。在低聚果糖中,1-蔗果三糖益生素活性最高。本研究将该酶展示在酵母菌细胞表面上,并用于1-蔗果三糖的制备。【方法】将来自莴苣的蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶基因克隆到用于酵母细胞表面展示的表达载体上,并在解脂亚罗酵母菌中进行异源表达,表达的酶展示在该细胞表面上,然后以蔗糖为底物,研究表面展示的蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶的性质。【结果】免疫荧光实验结果表明蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶已展示在酵母菌的细胞表面上,高效液相色谱结果表明酵母表面展示的该酶具有转移酶的催化活性。该酶的最适作用温度、最适作用p H分别为45°C和7.5;该酶的催化活性受Zn2+和Cu2+的抑制,受Ca2+激活;该酶重复使用7次后,酶活下降50%。表面展示的蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶和3%蔗糖混合后在40°C条件下孵育30 min后,所产1-蔗果三糖含量最高为20.8 mmol/L。【结论】蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶在解脂亚罗酵母菌中得到成功表达,并展示在其细胞表面上,生化研究表明该重组蛋白具有果糖基转移酶活性,且催化蔗果三糖的生成。表面展示的蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶作为一种全细胞催化剂能够用于1-蔗果三糖的制备。     

极端嗜热菌海栖热袍菌α-葡萄糖醛酸酶的高效表达和重组酶的纯化

α-葡萄糖醛酸酶作为木聚糖降解的限速酶之一,在木聚糖类半纤维素的生物转化中起着重要的作用。海栖热袍菌Thermotoga maritima是一个嗜极端高温的厌氧细菌,其产生的极耐热性酶类具有非常可观的工业应用前景。但热袍菌属Thermotoga的基因在大肠杆菌中的表达一般较困难。研究了T. maritima中的极耐热性α葡萄糖醛酸酶基因在大肠杆菌不同菌株中的表达水平及纯化技术。结果表明,稀有密码子AGA、AGG和AUA限制了该基因在大肠杆菌中的表达,在大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)RIL可得到高效表达,重组蛋白表达量达20%,比酶活比野生菌株提高5倍;重组蛋白经热处理和金属Ni²⁺的亲和层析提纯后,达到了电泳纯,提纯倍数为5.1倍,收率为55.1%。对重组菌诱导表达条件的研究表明,营养丰富的TB培养基有助于重组菌的生长, 重组菌生长至OD₆₀₀为0.7～0.8时添加IPTG诱导5h后重组蛋白的表达量最高。     

重组E．coli胆固醇氧化酶的分离纯化及其酶学性质研究

对重组E.coli产生的胆固醇氧化酶采用70%硫酸铵盐析、CM Sepharose FF离子层析、Phenyl Sepharose 6 Fast疏水层析、Sephadex G-75凝胶过滤,得到的胆固醇氧化酶在SDS-PAGE上呈单一蛋白质条带,酶的纯化倍数为93,收率为21%.部分酶学性质表明:酶的最适反应温度为37℃,最适反应pH7.5,热稳定范围在40℃以下,酶的pH稳定范围为6～9,分子量分别为50 kD和52 kD.酶动力学参数Km值及Vmax分别为8.2×10-5 mol/L和0.21 mmol/(L.min).     

假交替单胞菌XM2107嘌呤核苷磷酸化酶基因克隆表达、重组蛋白纯化及酶学性质

【目的】嘌呤核苷磷酸化酶(PNP,EC.2.4.2.1)在酶法合成核苷类药物及中间体中具有广泛应用。本文研究的目标是,获得极地嗜冷菌假交替单胞菌Pseudoa lteromonas sp.XM2107嘌呤核苷磷酸化酶编码基因,并对该酶酶学性质进行研究,以考察该酶在核苷类中间体及药物合成中的潜在应用价值。【方法】利用同源序列PCR技术从Pseudoa lteromonas sp.XM2107基因组DNA中扩增出其编码嘌呤核苷磷酸化酶基因,测序获得编码序列。将该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中进行重组表达以及金属螯合层析纯化,对其酶学性质进行初步研究。【结果】经过测序获得了该酶编码基因序列,全长702 bp,共编码233个氨基酸,大小为25 kDa,Genbank登录号为GQ475485。酶学性质研究发现,该重组酶最适反应温度为50℃,最适酶促反应pH为7.6(25 mmol/L磷酸盐缓冲液),最适酶促反应底物为肌苷(Km值0.389 mmol/L,37℃),且对底物腺苷和鸟苷也有磷酸解活性,在普通温度下具有较高催化活性和较好热稳定性。【结论】来源于Pseudoa lteromonas sp.XM2107的嘌呤核苷磷酸化酶在普通温度条件下具有较高的催化活性及良好热稳定性性质,在核苷类中间体和药物合成中具有较广泛的应用价值。     

α-氨基酸酯酰基转移酶表达纯化、酶学性质及其催化应用

α-氨基酸酯酰基转移酶(α-amino acid ester acyltransferase,AET)能够催化底物L-丙氨酸甲酯盐酸盐、L-谷氨酰胺合成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(L-alanyl-L-glutamine,丙谷二肽)。利用重组大肠杆菌saet-QC01表达α-氨基酸酯酰基转移酶,对其表达条件进行了优化,通过Ni-NTA亲和层析法分离纯化重组蛋白,并对其酶学性质、催化应用进行了研究。适合酶表达的诱导条件:温度20℃,诱导阶段(OD_(600)=2.0-2.5),IPTG浓度0.6 mmol/L,诱导时间12 h。α-氨基酸酯酰基转移酶的最适反应温度27℃,最适pH 8.5,在pH 7.0-8.0很稳定,在酸性条件下相对稳定,低浓度的Co~(2+)、低浓度的EDTA对酶活有促进作用。在底物浓度丙氨酸甲酯盐酸盐600 mmol/L、谷氨酰胺480 mmol/L,丙谷二肽的产量达到78.2 g/L,生产速率达到1.955 g/(L·min),转化率达到75.0%。α-氨基酸酯酰基转移酶具有良好的酸碱耐受性,催化效率高的优良特性,在工业生产中具有较好的应用潜力。     

黑曲霉CICIM F0410中α-葡萄糖苷酶的酶学性质研究

研究了黑曲霉(Aspergillus niger)CICIMF0410发酵粗酶液中α-葡萄糖苷酶的酶学性质,发现该酶最适反应温度为55℃,最适反应pH值5.0,在65℃以下保持酶活力相对稳定,且能在pH值(4.0～6.5)范围内保持相对较高的酶活力。以该菌株的染色体DNA为模板,PCR扩增出大小为3.1kb的片段,经序列比对发现与NCBI上已公布的黑曲霉(Aspergillus niger)CBS513.88(登录号XP_001402053)序列有2个碱基的区别:2272(A→G),3098(T→G),导致2个氨基酸残基的变化:687(Asn→Ser)、983(Ser→Arg)。     

β-葡萄糖苷酶Bgl747的定向筛选、重组表达与酶学性质

[背景]β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase,EC3.2.1.21)是3种纤维素酶中的重要成分之一.目前工业用纤维素酶大都来源于木霉等真菌,较少来源于细菌,而且在应用中还存在反应条件(温度、pH等)适用范围窄、酶活力较低、获取成本偏高等问题,这大大限制了β-葡萄糖苷酶的应用.从秸秆还田土壤细菌中筛选β-葡萄糖苷酶...     

红纹黄单胞菌α-氨基酸酯水解酶的分离纯化及酶学性质

【目的】从红纹黄单胞菌中分离纯化了胞内α-氨基酸酯水解酶(AEH),并进行了酶学性质研究。【方法】采用乙酸丁酯破碎细胞,并相继用磷酸钙凝胶沉淀、硫酸铵分级沉淀、DEAE Sephadex A-50阴离子交换处理、CM Cellulose 52离子交换层析和Sephadex G-200凝胶过滤层析纯化得到了电泳纯α-氨基酸酯水解酶,并研究了此酶的酶学性质。【结果】SDS-PAGE显示α-氨基酸酯水解酶的亚基分子量为70 kDa。酶促合成头孢克洛的最适pH为6.8,最适温度为42℃,在pH5.0-8.0和35℃以下,酶保持了良好的稳定性。Mn2+和Ca2+对酶活有一定的促进作用,Cu2+、Fe2+及高浓度的丙酮对酶活有强的抑制作用。AEH催化D-苯甘氨酸甲酯、D-对羟基苯甘氨酸甲酯和头孢克洛水解反应的kcat/Km分别为123.7±3.7 mmol-1.s-1.L、2.9±0.6 mmol-1.s-1.L和101.3±2.1 mmol-1.s-1.L,AEH对D-苯甘氨酸甲酯的催化效率最高。AEH催化双底物反应的机制为乒乓机制,催化合成头孢克洛的kcat为547.3±38.2 s-1。【结论】有关红纹黄单胞菌α-氨基酸酯水解酶的酶学性质研究相对较少,本文的研究将为该酶催化合成β-内酰胺类抗生素的工业化应用提供重要参数。