融合基因GAD-IL-4的克隆及其在毕赤酵母中的表达

谷氨酸脱羧酶(GAD)是糖尿病的始动靶抗原,白细胞介素4(IL-4)与自身免疫性疾病密切相关。本研究通过重叠延伸PCR(Gene splicing by overlap extension,SOE PCR)技术扩增得到融合基因GAD-IL-4,构建重组酵母表达载体pPIC9K-GAD-IL-4。线性化pPIC9K-GAD-IL-4,通过电转化法转化毕赤酵母菌GS115。以0.5%的甲醇对酵母工程菌GS115/pPIC9K-GAD-IL-4进行诱导表达。经SDS-PAGE检测,在发酵上清中出现与预期大小相符的蛋白条带,表明融合基因GAD-IL-4在酵母细胞中实现正确表达,为下一步利用重组融合蛋白GAD-IL-4奠定了良好的实验基础。     

glyA基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

根据已知的序列设计引物,以大肠杆菌XL10-Gold总DNA为模板进行梯度PCR,并进行DNA序列测定,其序列与已经报道的glyA基因完全一致。将其克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pHBM905C上,获得表达质粒pHBM1001.该质粒转化毕赤酵母GS115所得重组子经PCR验证后成功进行了诱导表达,并初步测定了酶活力。     

HrpN基因在毕赤酵母中的克隆表达与活性检测

将hrpN基因插入毕赤酵母表达载体pPIC6αA的醇氧化酶（AOX1）启动子下游,构建重组表达载体pPIC6aA-hrpN,经电击转化毕赤酵母菌株X-33和杀稻瘟素筛选,得到高效分泌表达harpin Ea的毕赤酵母菌株。经初步纯化、SDS-PAGE分析和生物测定,结果显示,诱导96h的此重组菌大量表达harpinEa表达产物具有诱导烟草超敏感反应的功能,活性高于在大肠杆菌中表达的harpinEa。     

纳豆激酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

纳豆激酶纳是从日本传统食品纳豆中发现的一类具有溶栓效果的蛋白酶,由于其具有安全,高效,作用时间长,易吸收,廉价等优点,现在正成为一个开发治疗血栓类疾病药物的研究热点。从本实验室保存的一株高溶栓的纳豆杆菌N07出发,提取总基因组DNA,利用PCR手段扩增获得了纳豆激酶长为825bp的成熟肽基因片段。构建重组表达质粒pPICZaA-NK,经EcoR I、Xba I双酶切、PCR、测序验证得出重组表达质粒上的外源基因即为825bp的目的片段;将重组质粒pPICZaA-NK用内切酶Sac I线性化后电击导入毕赤酵母X33,通过含Zeocin的YPDS平板筛选获得重组酵母。重组酵母在BMMY培养基中发酵培养,用1%甲醇诱导目的蛋白表达。用纤维蛋白平板法检测发现发酵上清具有纤溶活性,经硫酸铵盐析、透析、Sephadex-G50过柱等步骤分离得到纳豆激酶蛋白,进行SDS-PAGE鉴定表明,表达的纳豆激酶蛋白分子量为27KD。以尿激酶为标准,实验所得纳豆激酶发酵上清液溶栓活性约为195U/mL。成功的将纳豆激酶成熟肽基因在毕赤酵母X33中表达,为纳豆激酶基因工程进一步研究奠定基础。     

人胸腺素α1基因在毕赤酵母中的融合表达

根据已知人胸腺素1（human Thymosin α1,hTα1）的氨基酸序列和毕赤酵母偏爱密码子,人工合成了hTα1基因。用合成的hTα1基因取代核糖体蛋白（ribosomal protein,RP）基因5′端的84个碱基,组成重组基因hTα1-RP,连接到质粒pPIC3.5K上,构建表达质粒pPIC3.5K/hTα1-RP。表达质粒用电激法转化到毕赤酵母GS115菌株中。甲醇诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE和Western印迹结果证明,重组基因hTα1-RP在酵母中得到了表达,表达量约为25mg/L。 Construction and Expression of Recombinant Human Thymosin α1 Fusion Gene in Pichia pastoris HUANG Wen,LI Zhao-yu,JIN Li-ji,AN Li-jia Abstract:The human Thymosin α1 (hTα1) gene was synthesized according to the optimal codons of Pichia pastoris and was fused in 5' terminal of ribosomal protein (RP) gene using over lapping polymerase chain reaction.The fusion gene was inserted into expression vector of pPIC3.5K and was transformed into HIS4 mutant strain GS115 by electroporation.Both SDS-PAGE and Western blot indicated that this fusion protein was expressed.The expression level was about 25mg/L. Key words：human Thymosin α1; fusion protein; Pichia pastoris     

酸性木聚糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的分泌表达

运用“鸟枪法”克隆构建了环境微生物的基因组文库,并从中筛选得到一个酸性木聚糖酶基因,命名为xyl3,其在GenBank中的登录号为gb：AY300805。BLAST分析表明,该基因的序列同源性很低,其中仅存在很短的木聚糖酶基因的同源片段,其编码的木聚糖酶属于Glycosyl hydrolases family 10,与来源于Geobacillus stearothermophilus的intra—cellular xylanase在氨基酸水平具77％同源性。该基因经T4 DNA polymerase处理后,克隆至经限制性内切酶CpoⅠ和NotⅠ双酶切后的毕赤酵母表达载体pHBM905,获得重组质粒pHBM706。此重组质粒转化毕赤酵母GS115,经含有交联木聚糖的选择性培养平板和PCR扩增鉴定筛选得到重组毕赤酵母GS115（pHBM706）。以0．5％甲醇于28℃诱导产酶,测得重组毕赤酵母GS115（pHBM706）在诱导的第36h产酶达最高值,所产粗酶液酶活为0．177IU／mL。该酶的最适反应pH为5．5,最适反应温度为50℃。     

西方许旺酵母α-淀粉酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的分泌表达

目的:将带有完整自身信号肽的西方许旺酵母α-淀粉酶基因克隆到大肠杆菌中,验证西方许旺酵母α-淀粉酶基因能否在大肠杆菌中有效表达。方法:利用PCR扩增带有完整自身信号肽的西方许旺酵母α-淀粉酶基因,并将其接入Zeocin启动子片段,构建了重组表达载体GapZA,转化大肠杆菌,验证得到的阳性克隆菌株是否表达α-淀粉酶活性。结果:阳性克隆菌株均有α-淀粉酶活性。结论:证明了许旺酵母α-淀粉酶能在自身信号肽引导下分泌到大肠杆菌细胞外,并且表现出明显酶活。     

HrpN基因在毕赤酵母中的克隆表达与活性检测

将hrpN基因插入毕赤酵母表达载体pPIC6αA的醇氧化酶(AOX1)启动子下游,构建重组表达载体pPIC6αA-hrpN,经电击转化毕赤酵母菌株X-33和杀稻瘟素筛选,得到高效分泌表达harpinEa的毕赤酵母菌株。经初步纯化、SDS-PAGE分析和生物测定,结果显示,诱导96h的此重组菌大量表达harpinEa,表达产物具有诱导烟草超敏感反应的功能,活性高于在大肠杆菌中表达的harpinEa。     

植物防御素PD5基因在毕赤酵母中的分泌表达

将植物防御素PD5基因克隆到载体pPIC9的XholⅠ和EcoRⅠ位点之间,得到重组载体pPIC9／PD5。pPIC9／PD5经Bgt Ⅱ线性化,电转化法转入Pichia pastoris GS115,MD和MM平板筛选表型为His^＋Mut^S的转化子,PCR鉴定阳性转化子。转化子D24用BMGY培养至OD600为6．0时,经BMM诱导,上清液用Tricien—SDS—PAGE可检测到目标条带。同时经平板抑菌试验显示,D24的诱导发酵上清液可很好的抑制香蕉枯萎菌（Fusarium oxysporum f.sp.Cubense）及甘蓝黑腐菌[Xanthomona campestris（Smith）Dovosen]的生长。植物防御素PD5基因在毕赤酵母中得到表达。     

狐狸生长激素基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

为制备重组狐狸生长激素(fGH),采用RT-PCR方法,从银狐垂体中扩增fGHcDNA基因,利用SnaBI和NotI位点将fGH基因插入到酵母分泌型表达载体pPIC9K中α-因子信号肽的下游,构建成fGH基因的酵母分泌型表达载体pPIC9K/fGH,载体经SalI酶切线性化后,通过电转移将线性化的pPIC9K/fGH转化到组氨酸缺陷型酵母宿主菌GS115中。然后利用不含氨基酸的以葡萄糖为碳源的培养基(MD)和以甲醇为碳源的培养基(MM)筛选出组氨酸His+型和甲醇利用正型(Mut+)酵母重组体,再经G418加压筛选出高拷贝fGH基因的重组酵母,经摇瓶发酵培养和甲醇诱导使fGH进行分泌表达。结果表明本实验扩增的fGH基因序列与GenBank发表的序列基本一致,发酵液经SDS-PAGE和Western blotting检测证明构建的重组酵母能够分泌表达fGH,表达的fGH占发酵液总蛋白的34%,表达量达119mg/L发酵液。     

鸡传染性支气管炎病毒H株纤突蛋白S1基因的克隆及其在毕赤酵母中表达

鸡传染性支气管炎病毒(IBV)河南分离株H,经SPF鸡胚增殖,差速离心纯化病毒,SDS-蛋白酶K法抽提病毒RNA。参照IBV Bcaudette株纤突蛋白S1基因序列设计并合成引物,以其进行RT—PCR,成功地扩增出IBV H株S1基因。扩增产物经Bst YⅠ Hae Ⅲ和Pst Ⅰ酶切分析,结果表明,IBV H株S1基因的RFLP图谱与M41株S1基因的完全一致,初步断定IBV H株为Mass血清型。将IBVH株S1基因克隆于pGEM—T载体中进行序列分析,结果表明该基因全长为1611bp(从ATG到S前体蛋白裂解位点),与标准株M41和Beaudette的S1基因序列相比较,同源率分别达到97．39％和97、27％。将IBV H株S1基因亚克隆到pPICZ—A表达载体,转化毕赤酵母中,SDS—PAGE实验证实了IBV H株S1基因在毕赤酵母中得以表达,进一步用鸡抗IBV血清做Westernblot检测．证实了表达产物的抗原特异性。     

黑曲霉葡萄糖淀粉酶Ⅰ基因的克隆及在酵母中的表达

采用RT—PCR技术,从黑曲霉的菌丝体RNA中扩增出葡萄糖淀粉酶GAI的结构基因,将其连接到pPIC9载体中,转入巴斯德毕赤酵母GSll5中,获得12株Mut＇重组酵母;甲醇诱导目的蛋白分泌表达,葡萄糖淀粉酶酶活最高达180U／ml,占上清液蛋白的38％。通过GAI在巴斯德毕赤酵母中的表达,重点讨论了目的基因拷贝数,基因的偏爱性等对外源基因分泌表达的影响。     

人自身抗原SmB'的基因克隆和原核表达

目的:为建立新的自身抗体检测方法,自行克隆、表达和鉴定人自身抗原SmB'。方法:应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,从白血病淋巴细胞HL-60细胞株中克隆人自身抗原SmB'全长基因;将PCR产物直接进行TA克隆、鉴定及测序,再定向克隆至pGEX-5T载体中,转入大肠杆菌BL-21;阳性克隆经鉴定后在IPTG诱导下表达,产物行SDS-PAGE和Western印迹。结果:PCR产物长约700bp,与预期的657bp接近,测序结果与GenBank核酸数据库报道完全一致。pGEX-5T-SmB'重组阳性克隆酶切鉴定正确,SDS-PAGE和Western印迹结果显示融合蛋白相对分子质量为51000,具有天然人自身抗原SmB'的免疫原性。结论:克隆表达了人自身抗原SmB',为建立相应的自身抗体检测方法奠定了基础。     

USP22基因克隆及其融合蛋白真核表达载体的构建

目的克隆人类泛素水解酶22（ubiquitin—specific processing enzyme22,USP22）基因,构建与绿色荧光蛋白融合表达的真核载体。方法利用RT—PCR技术以HeLa细胞总RNA为模板分别扩增USP22基因cDNA序列两片段,依次插入真核表达载体pEGFP—N1;重组质粒转染HEK293T细胞,观察融合蛋白表达及绿色荧光的分布。结果测序结果显示USP22序列与GenBank收录数据一致,酶切显示重组质粒pEG—FP—USP22构建无误,质粒转染后有80％左右HEK293T细胞表达绿色荧光,且在胞质与胞核中广泛分布。结论成功克隆USP22基因并构建与GFP融合表达的真核载体,为进一步深入研究USP22基因的生物学功能奠定了基础。     

毕赤酵母甲酸脱氢酶在大肠杆菌中的融合表达及其酶学性质

为了获得高效融合表达的甲酸脱氢酶(FDH)工程菌,用PCR方法从毕赤酵母GS115(Pichia pastoris GS115)基因组DNA中克隆FDH基因,测序发现第106位多出一个脱氧腺嘌呤核苷酸,基因定点突变后重组至胞内融合表达型T载体pET-DsbA-T,得到重组质粒pET-DsbA-FDH,转化E.coli BL21(DE3),获得胞内融合表达型FDH工程菌。SDS-PAGE分析表明,融合蛋白表观分子量约为65×103,主要以可溶形式存在于胞内。进一步研究得知,酶的最适温度为54℃,最适pH为8.5;金属离子对酶活有较强的抑制作用,EDTA能增强酶活性。     

mMR-1基因的克隆和在毕赤酵母中分泌表达

hMR-1为本实验室首次克隆发现的一个人类新基因 ,是一种和三种肌肉收缩蛋白及多种细胞信号蛋白具有相互作用的膜蛋白。经与鼠基因组数据库进行同源分析后设计合成引物 ,利用RT-PCR技术从小鼠C57BL 6J脾脏T淋巴细胞总RNA中反转录得到鼠源MR-1基因 (mMR-1) ,提交GenBank ,收录号 (AY2 99972 )。序列分析证明其与人源MR-1基因 (hMR-1)同源性为 90.1%。构建表达载体pPIC9 mMR-1电转化PichiapastorisGS115 ,筛选得到整合分泌表达mMR-1蛋白的重组酵母菌株。表达目的蛋白分子量 25kD ,诱导 5d时产量达到 50mg/L ,通过Westernblot验证了表达产物的正确性。本研究为进一步研究新基因MR-1的生物学功能奠定了基础。     

水稻N-糖酰胺酶基因 (OsPNGase A) 的克隆及在毕赤酵母中的分泌表达

N-聚糖酶是一类广泛应用于糖蛋白的N-糖基化修饰研究中的去糖基化酶。本研究通过RT-PCR从水稻中克隆了一个高GC含量(69.48%)的N-聚糖酶基因(Os PNGase A,XM_015775832),通过无缝克隆技术构建酵母分泌型表达载体p PICZ(α)A-Os PNGase A,在毕赤酵母SMD1168H中进行诱导表达,发酵液经DEAE Sepharose阴离子交换层析和His Trap HP金属离子螯合层析纯化,产量可达到12.3 mg/L,比活力为258 U/mg。SDS-PAGE结果显示,纯化的Os PNGase A为单一条带且与预期分子量一致。Os PNGase A能作用于水稻中重组表达的人转铁蛋白(TRF)、玉米中重组表达的鸡蛋抗生物素蛋白(Avidin)以及辣根过氧化物酶(HRP),并且对Avidin的酶切效果优于商业化的PNGase F。Os PNGase A反应的最适p H和温度分别为p H 6.0和40℃,在中性和碱性以及含有100 mmol/L还原剂β-ME和DTT的条件下仍具有活性。水稻Os PNGase A的成功表达为植物糖蛋白的研究提供一个新的工具酶,酵母分泌表达体系的建立为PNGase A的大量制备奠定了基础。     

抗菌肽VIP在毕赤酵母中的高效表达及鉴定

基于人抗菌肽VIP(Vasoactive intestinal peptide)基因序列,按照毕赤酵母密码子偏好性设计引物;用SOE-PCR法扩增目的基因;然后将目的基因克隆至毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA上,构建VIP分泌表达菌株GS115-p PICZαA-vip。用甲醇诱导96 h收集上清,用质谱进行鉴定,结果显示分泌表达产物与人抗菌肽VIP理论值(3 326.82 Da)完全一致,表明人抗菌肽VIP成功得到分泌表达。琼脂糖凝胶扩散法实验结果显示,重组VIP对大肠杆菌Escherichia coli ATCC25922和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC25923都有很强的抗菌活性,MIC(Minimal inhibitory concentration)分别为8 mmol/L和16 mmol/L。进一步细胞毒性和溶血性实验结果显示,重组VIP对正常细胞NCM460和IPEC-J2没有毒性,其对SD大鼠红细胞不具有溶血活性。通过透射电镜观察了VIP的抗菌机制,结果显示VIP主要通过破坏细胞膜的方式抑杀细菌。本研究为人抗菌肽VIP的开发应用和大量生产奠定了基础。     

一种新的遍在蛋白融合基因Uba256的克隆及表达

斜纹夜蛾核多角体病毒 (Spodopteralituramulticapsidnucleopolyhedrovirus ,SpltMNPV)的Uba2 5 6基因是已知昆虫病毒基因组中惟一编码遍在蛋白与GP37融合蛋白的基因。通过PCR方法扩增得到该基因及其N端的遍在蛋白编码区与C端的GP37编码区。将这 3个基因片段分别克隆至质粒pBV2 2 0与pQE30 ,构建得到重组质粒pB VUBCP、pQEUB与pQECP。pBVUBCP转化大肠杆菌DH5α ,经热激诱导表达了一条 38kD的蛋白带 ,证明Uba2 5 6表达的蛋白在大肠杆菌中没有发生剪切。pQEUB、pQECP转化大肠杆菌M15 ,经IPTG诱导 ,Western印迹分析结果表明遍在蛋白与GP37蛋白获得高效表达。以Ni2 NTA偶联抗体检测证明所表达的蛋白质均为融合蛋白质。纯化的融合蛋白质免疫新西兰大白兔可诱导产生特异抗体。ELISA和Western印迹检测结果显示 ,SpltMNPV遍在蛋白抗体及GP37抗体均与表达的融合蛋白质呈阳性反应 ,表明所表达的融合蛋白质仍保持原有蛋白质的免疫原性。以获得的抗体对感染SpltMNPV 72h的Sl zsu 1细胞进行检测 ,发现仅有一条 34kD的蛋白质带与GP37抗体发生特异反应 ;而有 4条分子量分别为 14、2 4、33、5 1kD的蛋白质带与遍在蛋白抗体发生特异反应 ,表明Uba2 5 6基因表达的蛋白质在宿主细胞内发生了剪切。