中国对虾蜕皮抑制激素全长cDNA的克隆及序列分析

对虾的蜕皮活动由蜕皮抑制激素和蜕皮激素调控,蜕皮抑制激素是甲壳动物CHH家族神经肽的成员之一,通过抑制Y器官蜕皮激素的合成而调节蜕皮,以中国对虾（Fennropenaeus chinensis）眼柄总RNA为材料,采用cDNA末端快速扩增（RACE）方法。首次得到蜕皮抑制激素的全长cDNA（GenBank登录号：AF469187）。该全长cDNA大小为697bp,是由320bp的3′RACE产物和468bp的5′RACE产物拼接而成,Blast搜索结果显示,该全长cDNA与甲壳动物的MIH基因序列具有较高的相似性,用Clustal X进行多序列比较结果表明,由该全长cDNA推导的氨基酸序列与对虾类的MIH的氨基酸序列同源性最高,其中与日本对虾,斑节对虾,刀额新对虾MIH的同源性分别为95.1%,83.1%,79.1%,根据以上数据,推断该697bp的全长cDNA为编码中国对虾MIH前体的cDNA。进一步序列分析表明,编码中国对虾MIH前体cDNA包括312bp的开放阅读框,81bp的3′UTR和302bp的5′UTR;编码103个氨基酸的MIH前体分子包括信号肽和成熟肽,信号肽由28个氨基酸组成,成熟肽由75个氨基酸组成,成熟肽中6个半胱氨酸非常保守。     

三疣梭子蟹蜕皮周期中MIH基因mRNA水平与蜕皮激素浓度变化

甲壳动物的蜕皮过程被认为是由位于眼柄的X器-窦腺复合体(XO-SG)分泌蜕皮抑制激素(MIH)通过调节Y器(YO)合成蜕皮激素而调控的。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)发现MIH基因在三疣梭子蟹眼柄X器-窦腺复合体中表达最强。采用qRT-PCR分析了MIH基因在三疣梭子蟹蜕皮周期中的表达变化, 结果表明; A期为(0.42±0.08)倍, B期为(1.09±0.09)倍, C期为(1.35±0.16)倍, D₀亚期为(1.00±0.10)倍, D₁亚期(0.78±0.07)倍, D₂亚期为(0.27±0.08)倍, D_3/4亚期为(0.20±0.04)倍。采用高效液相色谱-电喷雾串联质谱(LC-MS/MS)法完成了三疣梭子蟹蜕皮周期中蜕皮激素(20E)浓度变化的测定。A/B期蜕皮激素的浓度较低, 低于仪器检测限0.33 pg, C期为(1.666±0.762) ng/mL, D₀亚期为(4.047±1.5133) ng/mL, D₁亚期为(6.756±4.928) ng/mL, D₂亚期为(8.609±3.827) ng/mL, D₃亚期为(19.534±4.799) ng/mL, D₄亚期为11.616 ng/mL。在三疣梭子蟹蜕皮周期中, MIH基因表达量与血淋巴中蜕皮激素浓度呈现一定拮抗性, 揭示MIH抑制Y器合成蜕皮激素而调控着三疣梭子蟹蜕皮的发生和进行。     

中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1(Ers-MIH1)基因组DNA的分子克隆和序列分析

运用反向PCR (IPCR)技术首次克隆得到全长为 3 50 6bp的中华绒螯蟹 (Eriocheirjaponicasinensis)蜕皮抑制激素 1(MIH 1)基因组DNA序列 (GenBank检索号 :AY3 10 3 13 )。该序列包括 3个外显子、 2个内含子、 412bp的 5′端上游调控区和 917bp的 3′端UTR。编码区的第 1个内含子将信号肽分开 ,第 2个内含子将成熟肽分开。MIH 1基因的外显子和内含子接头区符合受体拼接点和供体拼接点的GT AG法则。MIH 1基因412bp的 5′端侧翼区含有和其它真核基因相似的启动子元件 ,即包括与其它节肢动物高度相似的起始子、TATA盒以及cAMP效应元件结合蛋白的结合位点序列。中华绒螯蟹MIH 1基因的组织方式与斑纹和食用黄道蟹的MIH基因相同。推导的多肽由 75个氨基酸的成熟肽和 3 5个氨基酸的信号肽组成 ,成熟肽的氨基酸序列和食用黄道蟹、三叶真蟹及美洲黄道蟹的一致性在 64% -65%之间     

三疣梭子蟹Profilin基因全长cDNA的克隆与表达分析

三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）是我国沿海重要养殖品种之一,近年来养殖病害呈逐年上升趋势,制约了三疣梭子蟹养殖产业的健康可持续发展。克隆三疣梭子蟹免疫相关基因,研究免疫基因的功能和作用机制,可为三疣梭子蟹养殖病害的防治奠定基础。本研究从三疣梭子蟹血细胞全长cDNA文库中克隆了742 bp 的profilin基因全长cDNA。Profilin全长cDNA中开放阅读框长375 bp,编码125 aa。推导的三疣梭子蟹profilin理论等电点pI 5.87,氨基酸序列与冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）profilin同源性最高,序列一致性为42.9%。荧光定量RT-PCR分析结果显示在正常的三疣梭子蟹机体中,血细胞profilin表达水平最高,其次为肝胰脏;在致病菌副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）诱导后,血细胞中profilin表达量显著上升（P<0.01）,表明profilin可能参与了三疣梭子蟹的免疫防御反应,是一个免疫相关因子。     

黄鳝cGnRH-Ⅱ的cDNA克隆与序列分析

促性腺激素释放激素（Conadotropin-releasing hormone,GnRH）是一个保守的十肽神经家族激素,在脊椎动物的性腺发育和繁殖功能的维持方面起着重要的调控作用。本文通过运用RACE和RT-PCR方法,从黄鳝脑组织中克隆得到cGnRH-ⅡcDNA全序列,其核苷酸序列长度为617bp。该cDNA编码的cGnRH-Ⅱ的前体氨基酸序列结构组成与其他物种的cGnRH-Ⅱ前体结构一致,其推导的蛋白前体长度为83个氨基酸,包括一个信号肽、cGnRH-Ⅱ十肽和一个由蛋白水解位点（Gly—Lys—Arg）连接的GnRH联接肽,其中信号肽和联接肽的长度分别为21和49个氨基酸。cGnRH-Ⅱ的氨基酸序列和其他相关物种cGnRH-Ⅱ氨基酸序列比较结果显示,cGnRH-Ⅱ cDNA的蛋白编码区高度保守,而非编码区的保守性程度很低。     

牛促卵泡激素α亚基cDNA的克隆与序列分析

从牛脑垂体中提取总RNA, 分离mRNA, 反转录获得cDNA, PCR扩增获得长为380 bp的牛促卵泡激素α亚基cDNA片段, 将它克隆于pUC19中, 进行序列分析, 结果表明: 所克隆的α亚基基因编码区序列与Erwin所发表的序列基本相同, 仅编码第24位赖氨酸的密码有差异, 同时将所获基因的核苷酸序列及相应氨基酸序列与人、啮齿类的同类基因相比较, 具有很高的同源性.     

三疣梭子蟹胚胎发育早期的组织学研究

对三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus)胚胎发育早期（卵裂至原肠胚期）进行了组织学观察。结果发现：卵排至体外约５２h后开始卵裂,卵裂方式为表面卵裂,卵裂至２５６细胞时,胚胎发育进行了囊胚期。囊胚为实囊胚,囊胚后期,１６个排成例嗽叭形的预定内胚层细胞与聚在其附近的其他细胞一起内陷形成原肠。预定内胚层细胞脱离原肠后,进行１次切向分裂,形成卵黄细胞和内胚层细胞,与此同时,胚工细胞不断分裂,产生视叶原基和胸腹原基,不久,２个胞腹原基逐渐愈合形成胸腹突。随胚胎发育,在似桥细胞带上出现大颚原基、大触角原基,随后大大触角原基与视叶原基之间的腹中线上发生口凹,在小触角原基产生后,胚肥发育进入卵内无节幼体期。     

三疣梭子蟹卵子发生的研究

１９８９年９月－１９９１年１月、作者利用透射电镜在超微结构水平研究了浙江舟山沿海的三疣梭蟹的卵子发生过程。实验结果得自于１２次取得的１５０号样品。根据核和胞质的变化我们把该蟹的卵子发生分为五期；卵原细胞分裂转化为卵原细胞；卵母细胞发育早期；卵母细胞发育中期；卵母细胞发育晚期；卵子形成期。     

三疣梭子蟹不同组织同工酶的分析

采用垂直板状聚丙烯酰胺凝胶电泳技术 ,分析了三疣梭子蟹 (Portunustriuberbuculatus)雌性成体心脏、鳃、肌肉、眼睛、肝胰腺和卵巢 6种组织中的 1 0种同工酶 (ADH、MDH、ME、LDH、α AMY、GDH、SOD、SDH、EST和GOT)的分化表达模式 ,并对各种酶的同工酶位点表达及酶谱表型进行了分析。结果显示 ,三疣梭子蟹的同工酶系统具有明显的组织特异性。     

甲壳动物蜕皮抑制激素调控机制的研究进展

甲壳动物的蜕皮过程主要是由Y器(Y-organ)分泌的蜕皮类固醇激素与X器-窦腺复合体(X-organ-sinus gland,XO-SG)分泌的蜕皮抑制激素MIH相互拮抗而进行调控的。而MIH调控机制较为复杂,且存在争议。本文就MIH调控机制的研究进展,包括研究方法,以及目前调控机制中争议最大的3个问题:MIH受体、cAMP与cGMP功能以及Ca2+功能作一综述。     

北极狐GHR基因cDNA的克隆及序列分析

本文根据狗(AF133835)的GHR基因cDNA编码全序列设计了三对引物,利用RT-PCR方法克隆出北极狐GHR基因编码区全长cDNA序列(GenBank accession No.EU304325)。结果表明,北极狐GHR的ORF为1917bp,编码638个氨基酸的前体蛋白,由18个氨基酸的信号肽和620个氨基酸的成熟肽组成。通过同源性比较发现北极狐与狗的同源性最高,达到98%。另外,利用邻接法(NJ法)构建的分子系统进化树聚类结果表明,北极狐与狗先聚为一类,该聚类结果与传统的物种进化关系基本一致。另外,通过氨基酸对位序列比较发现,北极狐GHR在氨基酸序列上存在明显的特异性,如45和451位分别为A和E,而其它物种均分别为T(大鼠为K)和A(牛羊为V,鼠为T)。     

Molecular cloning of growth hormone encoding cDNA of Indian major carps by a modified rapid amplification of cDNA ends strategy

A modified rapid amplification of cDNA ends (RACE) strategy has been developed for cloning highly conserved cDNA sequences. Using this modified method, the growth hormone (GH) encoding cDNA sequences ofLabeo rohita, Cirrhina mrigala andCatla catla have been cloned, characterized and overexpressed inEscherichia coli. These sequences show 96–98% homology to each other and are about 85% homologous to that of common carp. Besides, an attempt has been made for the first time to describe a 3-D model of the fish GH protein.     

甘蓝夜蛾几丁质酶基因cDNA序列的克隆与序列分析

昆虫几丁质酶在害虫生物防治中具有很大的发展潜力。以甘蓝夜蛾Mamestra brassicae L.预蛹期幼虫整个虫体为材料提取总RNA,利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(RACE),扩增得到其几丁质酶的cDNA序列。该序列含有2826个碱基,包括1个1689个碱基的开放阅读框,预测编码1个含562个氨基酸的多肽,分子量约为62.6kDa,等电点为5.30。推导得到的氨基酸序列含有2个N-位糖基化位点,22个O-位糖基化位点,氨基酸序列与其他昆虫,尤其是鳞翅目昆虫的几丁质酶高度同源。获得的甘蓝夜蛾几丁质酶基因cDNA序列已经登录GenBank并获得登录号FJ436415。     

不同产地三疣梭子蟹的稳定同位素比值特征及原产地溯源

探索稳定同位素对三疣梭子蟹产地溯源的可行性,可为保护地理标志产品、追溯原产地来源提供理论依据.本研究以黄海、渤海和东海3个主产区海域的三疣梭子蟹为对象,分析了其碳、氮稳定同位素值差异性和不同组织中稳定同位素比值的相关性.结果 表明:不同产地的碳、氮稳定同位素比值有显著性差异,不同组织之间有明显的同位素分馏效应.利用建立...     

大熊猫生长激素受体(GHR)cDNA的克隆与序列分析

根据已报道的若干物种GHR 基因cDNA 序列设计引物, 利用RT- PCR 技术首次从大熊猫肝脏组织总RNA中扩增出GHR 基因编码区全长cDNA 序列, 克隆于pGEM®-T 载体后进行测序和序列分析。结果表明,大熊猫GHR 的ORF为1 917 bp , 编码638 个氨基酸的前体蛋白, 由18 个氨基酸的信号肽和620 个氨基酸的成熟肽组成,与人、狗、猪GHR 结构相似, 大熊猫GHR 成熟肽由246 个氨基酸的胞外区、24 个氨基酸的跨膜区和350 个氨基酸的胞内区组成, 并具GHR 的特征性结构。序列相似性比较显示, 大熊猫GHR 与哺乳类GHR 具有69 %～93 %的高序列相似性, 与爬行类和鸟类的序列相似性也达到60 % , 而与鱼类的序列相似性较低, 仅为30 %左右。与其它哺乳动物GHR 相比, 大熊猫GHR 在氨基酸序列上也存在明显的特异性。     

室内养殖条件下三疣梭子蟹的生殖蜕壳和交配行为

本文采用外部特征观察和红外线摄像,对室内配对养殖三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)的生殖蜕壳和交配行为进行了系统研究。结果发现:近交配季节,雌性三疣梭子蟹腹甲出现蓝黑色并不断加深,游泳足掌节则最终汇聚成一轮红色月牙,这些体表特征集中出现在生殖蜕壳前期,可能是除信息素外,另一类用于交配活动的视觉信号。三疣梭子蟹的交配活动起始于两性间的求偶抱对行为,雌性完成生殖蜕壳便进行软壳交配,这是一个连续的过程,包括随后的抱对守护行为;期间,相对于交配前后的抱对行为,三疣梭子蟹用于实质性交配活动的时间十分有限。然而,这可能是一种生殖策略:一方面,雌性可以采用抱对这种方式确保随后进行的生殖蜕壳及软壳交配过程能在有限的时间内安全有序地完成;另一方面,作为补偿,雄性可通过交配活动在雌性生殖道内生成精子塞来保证父权,减少个体间的竞争。