AtAAPT1基因RNAi的植物表达载体的构建

以拟南芥中氨基乙醇磷酸转移酶基因AAPT1作为RNA i的靶向序列,采用RT-PCR的方法获得目的DNA片段。然后以pBS-T-AAPT1载体为基础,构建了由35 s启动子调控的AAPT1基因RNA i的植物表达载体pART27-AAPT1(1,2),并通过电击法将重组质粒导入根癌农杆菌C58中。AtAAPT1基因RNA i的植物表达载体的构建对于研究AAPT1基因的功能和应用具有重要的理论价值。     

梅PGIP基因超表达载体的构建及遗传转化

运用已克隆的梅PGIP基因构建植物超表达载体,将PGIP插入带有启动子super-promoter和终止子nos的中间载体P-Super1300 中,酶切鉴定表明,目的基因已正确地插入载体中.用根癌农杆菌介导法将其转入烟草中,共获得25株潮霉素抗性苗,对其中的13株进行PCR检测,有12株扩增出了目的条带;进一步对其中的7株进行Southern杂交检测和RT-PCR检测,发现7个株系均有杂交带出现,且均发生了基因转录,说明已成功获得了能够表达PGIP基因的转基因烟草.     

野生罂粟RNAi表达载体的构建及遗传转化

通过PCR方法从质粒pGEM-bc中克隆野生罂粟BBE-COR融合基因片段约760 bp,以pHANNIBAL和植物表达载体pCAMBIA3300为基础,将克隆到的BBE-COR融合基因正向和反向片段分别插入pdk内含子的两边,经酶切、PCR鉴定及序列分析表明,特异性RNAi表达载体p3300-pHR构建成功.采用直接转化法,将重组子导入根癌农杆茵AGL1中.以野生罂粟茎尖生长点为转化受体,用农杆茵介导法将目的基因转入野生罂粟中.经卡那霉素和除草剂筛选后,共获得53株转基因植株,PCR检测后,其中14株表现阳性,可初步确定目的基因已经整合到野生罂粟基因组中.     

玉米Lc基因植物表达载体构建及菊花转化

Lc基因是从玉米中分离得到的与花青素合成相关的调节基因,它在多种植物中的异源表达可以增加花青素的含量.本研究对pBI121载体Gus基因后的终止子进行2次PCR扩增,在原Sac Ⅰ酶切位点后添加了新的Sac Ⅰ酶切位点,利用组织化学染色法检测,结果表明改造后的载体上的Gus基因能正常表达,终止子功能正常,载体改造成功.用改造的pBI121N构建了含有Lc基因的植物表达载体pBl121N-Lc,利用农杆菌介导法转化菊花叶盘,获得了19株生根抗性苗.通过提取抗性苗基因组总DNA,PCR扩增Lc基因和CaMv35S启动子获得了11个阳性株系,PCR结果表明Lc基因已经转入菊花中.同时,在已获得的转基因植株中发现7个株系的根系有变红的现象.     

薄荷GPPS基因原核表达及RNA干扰载体构建

利用薄荷挥发油合成途径关键酶之一的薄荷牻牛儿基焦磷酸合酶(GPPS)基因特异引物,扩增得到GPPS基因开放式阅读框(1 131 bp),并将其插入到原核表达载体pET-28a中,经酶切测序验证的重组质粒pET-28a-GPPS转入Rosetta(DE3),利用IPTG诱导表达融合蛋白。结果显示,终浓度为1 mmol/L的IPTG进行诱导后6 h,SDS-PAGE显示薄荷GPPS基因在Rosetta(DE3)中获得高效表达。目前利用RNA干扰技术研究基因功能的方法已日趋成熟,以GPPS大亚基基因为靶目标,成功构建了薄荷GPPS大亚基基因的pBI121-RNAi-GPPS干扰载体。     

DNA甲基转移酶RNAi干涉载体的构建及其鉴定

DNA甲基化(DNA Methylation)是真核生物基因组最常见的DNA共价修饰形式,影响蛋白质-DNA的相互作用,在基因表达的调控上起着重要作用,RNAi(RNA interference)干涉是关闭特定基因功能的新技术,在植物功能基因组、植物发育及生理代谢途径调控等方面有着广泛应用.本文根据植物DNA甲基转移酶(DNMTs)的保守序列设计引物,首先从拟南芥总基因组DNA中克隆出DNA甲基转移酶基因保守片段,然后以此保守片段为模板扩增长度约570bp,的靶序列用于构建RNAi载体.根据RNAi作用机制,将570bp靶序列正向、反向连接到pHANNIBAL载体上,然后将带有此反向重复结构的完整OFF框连接到植物表达栽体pGreell上,经过酶切鉴定和测序分析证实DNA甲基转移酶RNAi重组表达载体构建成功.转化红豆衫细胞表明该干涉载体具有生物学功能,为研究受DNA甲基化调控的性状改良打下基础.     

Bt基因甜菜叶绿体转化载体构建及毒蛋白表达

利用植物叶绿体基因组在进化中高度保守的特点,根据烟草、菠菜、水稻叶绿体基因组全序列资料设计合成引物,PCR扩增并克隆了甜菜叶绿体两个重要功能基因rbcL和atpB(GenBank登录号分别为DQ067450和DQ067451),并以其作为定点整合外源基因的同源重组片段,构建了Bt基因CryIAc甜菜叶绿体定点转化载体pSKARBt,酶切鉴定表明:所构建载体符合预期设计。对克隆菌菌体总蛋白进行了生物杀虫试验,结果表明:Bt基因CryIAc能够在叶绿体特异性启动子及终止子的调控下表达,并对二龄末甘蓝夜蛾有很强的毒杀作用。该载体构建对培育甜菜高抗虫品种具有重要应用价值。叶绿体转化及后续工作正在进行中。     

小拟南芥chitinase基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

以野生资源小拟南芥(Arabidopsis pumila)chitinase基因的cDNA为基础,采用基因重组技术,将该基因按正确的阋读框架定向克隆于原核表达载体pET-30a( )中,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE分析.结果表明:重组小拟南芥chitinase基因在大肠杆菌中获得高效表达,其分子量约为40 KD.小拟南芥chitinase基因原核表达载体的成功构建和重组小拟南芥chitinase蛋白在大肠杆菌中的高效表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.     

玉米FAD2基因RNA干涉表达载体的构建及转化

根据已克隆的ZmFAD2基因(GenBank登陆号:DQ496227)设计引物,通过RT-PCR扩增得到120 bp的特异性基因片段作为hpRNA干涉片段。利用pUCCRNA i与pUb i.cas为中间载体,成功构建了含Ub iqu itin启动子和hpRNA i片段的干涉表达载体p1 300 UFIFN。以自主选育的高油玉米自交系幼胚为材料,诱导、继代出胚性愈伤组织,利用携带p1 300 UFIFN质粒的根癌农杆菌LBA4404对其进行遗传转化。对抗性植株进行PCR检测,共获得6株转基因阳性株。     

银杏CONSTANS基因植物表达载体构建

目的:构建银杏CONSTANS基因的表达载体.方法:PCR扩增CO基因得到1.2kb左右的片段,用BamH Ⅰ+HindⅢ酶切纯化,通过T4 DNA连接酶连接到植物表达载体pCAMBIA 1304上,并转化到农杆菌LBA4404,然后进行菌落PCR及酶切鉴定.结果:载体构建成功.结论:构建了GbCO正义链和反义链的植物表达载体pCAMBIA 1304-GbCOs和pCAMBIA 1304-GbCOa,可用于GbCO基因的转基因功能研究.     

桃蚜体内与病毒结合的共生菌Buchnera groEL基因的克隆和序列分析

以桃蚜（Myzus persicae)杨凌生物型为材料,利用一对特异性引物,用PCR的方法从桃蚜体内扩增出了内共生菌的Buchnera groEL基因,序列测定结果表明其长度为1647bp,与GenBank中的桃蚜荷兰生物型、蜿豆蚜（A-cyrthosiphon pisum)日本生物型Buchnera GroEL基因长度相同,同源性分别为99%和91%;Buchnera GroEL-YL编码548个氨基酸,序列比较发现与BuchneraGroEL-NT仅有3个氨基酸的差异,即AA111Met→Lys,AA222Val→MetandAA348Gln→His。     

棉蚜Catb5基因RNAi载体的构建及其对烟草的转化

依据细胞色素氧化酶亚基Ⅰ序列的多态性设计特异性引物,通过PCR技术扩增出的特异性条带鉴定为棉蚜。提取棉蚜总RNA,利用RT-PCR技术从棉蚜中扩增出大小为515 bp的Catb5目的基因,进一步将两段Catb5基因分别正向和反向连接到植物表达载体pBi35SG12上,构建了pBi35SC5 RNAi表达载体,并通过农杆菌介导法导入烟草中,PCR检测表明已得到转基因烟草再生苗。     

油菜BnCr4基因RNAi载体构建及植株转化

该实验构建了含甘蓝型油菜黄化相关基因BnCr4特异片段反向重复结构的RNA干扰(RNAi)载体pFGC5941-Cr4,通过根癌农杆菌介导转化油菜,获得47株抗Basta的抗性再生油菜植株,其中10株经PCR鉴定为阳性转基因植株.随机选取3株经鉴定的转基因阳性油菜植株进行半定量RT-PCR分析,结果显示,相对于非转基因的野生型油菜,3株转基因植株中BnCr4基因的表达量分别降低了78.5%、8.5%、11.8%,表明该干扰载体转入油菜能特异引起植株BnCr4基因表达量下降.     

小麦Vp-1基因RNA干扰表达载体的构建及遗传转化

小麦成熟期穗发芽是世界性的自然灾害,严重影响小麦的产量和品质.Viviparous-1(Vp-1)是促进胚成熟和休眠的主要转录调节因子,与小麦穗发芽抗性有着密切的关系.本实验根据小麦Vp-1基因序列,以植物表达载体pAHC25为基础,成功构建了含有反向重复序列的RNA干扰表达载体pAHC-WVpRi.采用基因枪法轰击小麦品种新春9号幼胚材料1825个,共获得34株T0再生植株.利用Bar基因引物和干扰片段特异引物对再生植株进行PCR检测,获得Bar基因和干扰片段均为阳性的植株3株,转化率为0.16%.本研究为深入分析Vp-1基因功能,进而通过分子育种进行小麦穗发芽抗性的遗传改良提供了科学依据.     

不同龄期的大草蛉对桃蚜的捕食作用

大草蛉Chrysopa pallens(Rambur)是我国分布较广、捕食能力较强的天敌昆虫。为明确大草蛉对桃蚜Myzus percicae潜在的控制能力,在室内研究了大草蛉不同龄期幼虫和成虫对桃蚜的捕食作用,以及种内干扰对大草蛉捕食的影响。结果表明：25℃恒温条件下,大草蛉成虫和幼虫对桃蚜的捕食功能反应可拟合HollingⅡ圆盘方程,在24 h内大草蛉成虫、1龄幼虫、2龄幼虫和3龄幼虫对桃蚜理论最大捕食量分别为370.4头、21.5头、112.4头和217.4头。大草蛉成虫和幼虫对桃蚜的捕食量均随着猎物密度的增加而增加,当桃蚜数量增加到150头后,大草蛉成虫和幼虫捕食量的增加速度明显减缓。成虫及幼虫对桃蚜的搜寻效应随着猎物密度的增加而降低,内干扰作用随着大草蛉虫龄的增加而增强。试验结果表明大草蛉对桃蚜具有较强的控害能力,对研究桃蚜生物防治技术有重要参考价值。     

Identification of indole glucosinolate breakdown products with antifeedant effects on Myzus persicae (green peach aphid)

The cleavage of glucosinolates by myrosinase to produce toxic breakdown products is a characteristic insect defense of cruciferous plants. Although green peach aphids ( Myzus persicae ) are able to avoid most contact with myrosinase when feeding from the phloem of Arabidopsis thaliana , indole glucosinolates are nevertheless degraded during passage through the insects. A defensive role for indole glucosinolates is suggested by the observation that atr1D mutant plants, which overproduce indole glucosinolates, are more resistant to M. persicae , whereas cyp79B2 cyp79B3 double mutants, which lack indole glucosinolates, succumb to M. persicae more rapidly. Indole glucosinolate breakdown products, including conjugates formed with ascorbate, glutathione and amino acids, are elevated in the honeydew of M. persicae feeding from atr1D mutant plants, but are absent when the aphids are feeding on cyp79B2 cyp79B3 double mutants. M. persicae feeding from wild-type plants and myrosinase-deficient tgg1 tgg2 double mutants excrete a similar profile of indole glucosinolate-derived metabolites, indicating that the breakdown is independent of these foliar myrosinases. Artificial diet experiments show that the reaction of indole-3-carbinol, a breakdown product of indol-3-ylmethylglucosinolate, with ascorbate, glutathione and cysteine produces diindolylmethylcysteines and other conjugates that have antifeedant effects on M. persicae . Therefore, the post-ingestive breakdown of indole glucosinolates provides a defense against herbivores such as aphids that can avoid glucosinolate activation by plant myrosinases.     

Myzus persicae (green peach aphid) feeding on Arabidopsis induces the formation of a deterrent indole glucosinolate

Cruciferous plants produce a wide variety of glucosinolates as a protection against herbivores and pathogens. However, very little is known about the importance of individual glucosinolates in plant defense and the regulation of their production in response to herbivory. When Myzus persicae (green peach aphid) feeds on Arabidopsis aliphatic glucosinolates pass through the aphid gut intact, but indole glucosinolates are mostly degraded. Although aphid feeding causes an overall decrease in Arabidopsis glucosinolate content, the production of 4-methoxyindol-3-ylmethylglucosinolate is induced. This altered glucosinolate profile is not a systemic plant response, but is limited to the area in which aphids are feeding. Aphid feeding on detached leaves causes a similar change in the glucosinolate profile, demonstrating that glucosinolate transport is not required for the observed changes. Salicylate-mediated signaling has been implicated in other plant responses to aphid feeding. However, analysis of eds5, pad4, npr1 and NahG transgenic Arabidopsis, which are compromised in this pathway, demonstrated that aphid-induced changes in the indole glucosinolate profile were unaffected. The addition of purified indol-3-ylmethylglucosinolate to the petioles of cyp79B2 cyp79B3 mutant leaves, which do not produce indole glucosinolates, showed that this glucosinolate serves as a precursor for the aphid-induced synthesis of 4-methoxyindol-3-ylmethylglucosinolate. In artificial diets, 4-methoxyindol-3-ylmethylglucosinolate is a significantly greater aphid deterrent in the absence of myrosinase than its metabolic precursor indol-3-ylmethylglucosinolate. Together, these results demonstrate that, in response to aphid feeding, Arabidopsis plants convert one indole glucosinolate to another that provides a greater defensive benefit.     

球孢白僵菌对温室蚜虫的侵染生物学

研究了球孢白僵菌在不同浓度、施菌方式、温度和相对湿度下对温室蚜虫的侵染力以及接种后对蚜虫的侵染速率。结果表明,高(109个孢子.mL-1)、中(108个孢子.mL-1)、低(107个孢子.mL-1)3个浓度剂量对蚜虫都有较强的致病力,且浓度越大,蚜虫的死亡率越高,死亡时间越提前。用浸渍法和孢子浴法接种蚜虫,6 d的累积死亡率分别为100%和31.1%。在测试的3个温度(22、26、30℃)中,26℃时蚜虫侵染力最强,第3天出现死亡高峰,第5天时累积死亡率就达到100%,明显高于22、30℃的处理。相对湿度越大,球孢白僵菌的致病力越强,蚜虫死亡速度越快。在温湿度组合中相对湿度为95%时,温度对白僵菌的侵染力几乎无影响,但影响发病速度,相对湿度低于95%时,26℃的侵染力始终高于22和30℃时的侵染力。通过接种后不同时间段用0.2%百菌清处理蚜虫测定该菌株的侵染速率,结果表明接种后24 h是该球孢白僵菌有效侵染蚜虫的关键时期。     

烟蚜在山东烟田的发生与消长

对山东烟区烟蚜Myzus persicae(Sulzer)的发生消长规律进行7年的系统调查。结果表明:烟蚜的发生为单峰型曲线,发生高峰大致在每年的5月底6月初,大多数年份不能形成第2个蚜量高峰,且烟蚜的发生以无翅蚜为主。并对以无翅蚜为主以及近年来烟蚜田间发生的数量较少的原因进行分析。