应用旋转生物反应器批量制备拟胚体的研究

以小鼠胚胎干细胞(ES-D3)为模型,应用新型细胞培养系统——STLV型旋转生物反应器(rotarycellculturesystem,RCCS)建立一种批量制备拟胚体(embryoidbodies,EBs)的新方法,研究不同细胞接种密度及培养时间对RCCS内EBs产生效率的影响。为了进一步研究该制备方法是否对EBs的分化潜能产生影响,对照传统方法制备的EBs,利用形态学及RT-PCR方法测定经旋转生物反应器制备的EBs在自发性或诱导条件下(1%DMSO)向心肌细胞的分化能力。结果表明:ES-D3在RCCS内能够高效形成EBs,与传统的直接悬浮法比较,其EBs的形成效率可达到后者的2倍。1×104个/ml为最佳细胞接种密度,培养时间也是在RCCS制备EBs过程中的重要因素之一,培养第4~5天为最佳收获EBs的时间。与悬滴法制备的EBs比较,该方法制备的EBs分化为心肌细胞的潜能未改变。由此,应用旋转生物反应器可以高效制备EBs,该方法制备的EBs可以用于发育生物学等基础及应用领域的相关研究。     

通过形成类胚体诱导人羊水多能干细胞向心肌细胞分化

由人羊水中分离羊水多能性干细胞,通过形成类胚体诱导其向心肌细胞分化.取人羊水标本进行体外培养,分离得到人羊水干细胞,已连续传代培养至42代,采用免疫细胞化学、RT-PCR和流式细胞仪技术对羊水干细胞的生物学特性进行检测.取10～15代羊水干细胞,悬浮培养使其形成类胚体,进而向心肌细胞诱导分化.培养的羊水干细胞呈成纤维样,表达部分胚胎干细胞特异标志基因,悬浮培养可形成类胚体.类胚体碱性磷酸酶(AP)检测呈阳性,表达三胚层特异标志基因fgf5、ζ-globin和α-fetoprotein.羊水干细胞形成类胚体后进行诱导,得到α-actin阳性细胞,表达心肌细胞特异标志基因Tbx5、Nkx2.5、GATA4和α-MHC.试验结果表明,从人羊水标本中可分离得到具有胚胎干细胞特性的细胞,经初步检测确定为羊水干细胞,并能通过形成类胚体诱导其向心肌细胞分化.     

小鼠胚胎干细胞分化形成拟胚体过程中的细胞程序性死亡

为了检测小鼠胚胎干细胞 (embryonicstemcell ,ES细胞 )体外分化的拟胚体 (embryoidbodies ,EBs)形成过程中细胞程序性死亡 (programmedcelldeath ,PCD)的发生 ,通过悬滴、悬浮培养技术定向诱导未分化的ES细胞分化为拟胚体 ,并用RT PCR检测原始内胚层、原始外胚层、中胚层、内脏内胚层 4种分子标记物在EBs中的表达 .通过TUNEL染色、电镜、激光共聚焦显微镜及Western印迹以确定凋亡发生 .结果表明 :ES细胞体外分化为拟胚体并且表达各胚层相应的分子标记物 ;在拟胚体的发育过程中出现明显的空腔化过程 ,TUNEL染色及电镜观察到凋亡生成 ,同时线粒体膜电位 (ΔΨm)在拟胚体发育过程中降低 ,通过Western印迹检测到caspase3、caspase8的激活 .表明小鼠ES细胞所分化的拟胚体可以作为研究早期胚胎发育的实验模型 ,线粒体在拟胚体的细胞程序性死亡过程中发挥重要的作用 .为进一步利用拟胚体研究细胞程序性死亡及相关信号分子在小鼠胚胎发育早期的作用奠定了基础     

长期培养小鼠胚胎干细胞拟胚体(EB)的观察

胚胎干细胞在体外培养条件下能够维持自我更新,并具有向多种细胞类型分化的能力,因此被广泛用于研究细胞分化的分子机理以及药物筛选.形成拟胚体(Embryoid body,EB)是胚胎干细胞分化常用的技术手段.为了便于今后利用EB做进一步的药物筛选及分化研究,严格规范了形成EB的条件,得到了分化状态均一性很高的EB.利用这一条件,观察到在分化条件下长期培养(长达60 d)的EB中仍有表达各项多能性指标的细胞集落.有关这一现象的进一步分析工作正在进行中.     

利用胚胎干细胞分化的拟胚体研究小鼠早期胚胎发育过程

小鼠胚胎干细胞(ES细胞)具有分化的全能性已经得到广泛共识。ES细胞在体外分化所形成的拟胚体在结构上能够模仿早期胚胎发育过程,包括在内细胞团表面形成内胚层、柱状上皮细胞的分化,以及中央空腔的形成。本文介绍利用拟胚体研究小鼠早期胚胎发育过程中各个胚胎阶段的发育、细胞程序性死亡的发生及TGF-β信号在胚胎发育过程中的作用。     

桥式PCR，一种简易连接DNA标签序列的方法

MAST方法采用人工文库的DNA标签序列鉴定mRNA的可接近位点。大量的标签序列通过扩增和克隆测序达到阐明mRNA结合位点图。设计了单一引物的PCR,其引物在标签序列两端结合搭桥,在扩增中DNA标签序列在搭桥引物的作用下进行连接,连接的标签序列再克隆和测序。十几条这样的连接产物包含了上千条标签序列。该PCR方法简单、高效以用于高通量的方式对标签序列测序。     

人胚胎干细胞和拟胚体基因表达谱的初步分析

利用人类全基因组Affymetrix芯片检测人胚胎干细胞与其自发分化7d的拟胚体之间的差异表达基因.结果显示:与未分化的人胚胎干细胞相比.在分化7d的拟胚体中表达下调2倍及以上的已知和未知基因共有1100个,表达上调2倍及以上的已知或未知基因共有2283个.利用Gostat对这些差异表达基因进行功能分析,发现它们分别与细胞的生物代谢过程、信号传导通路、系统发育、细胞分化、分子功能及亚细胞组分相关.胚胎干细胞具有自我更新能力,是研究早期胚胎发育理想的细胞模型,因此对差异表达基因的功能研究有助于了解维持人胚胎干细胞自我更新的分子机制以及胚胎发育早期的分子事件.     

胚胎干细胞及诱导多能干细胞向心肌细胞分化和调控的研究进展

胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESCs）具有自我更新、无限增殖和多向分化的特性,包括分化成心脏组织的多种类型细胞。经体细胞重编程产生的诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPS）也被证明有类似胚胎干细胞的特性。但这些多能干细胞向心肌细胞自发分化的效率非常低,因此,如何有效地诱导这些多能干细胞向心肌细胞的定向分化对深入认识心肌发生发育的关键调控机制和实现其在药物发现和再生医学,如心肌梗塞、心力衰竭的细胞治疗以及心肌组织工程中的应用均具有非常重要的意义。该文重点综述了近年来胚胎干细胞及诱导多能干细胞向心肌细胞分化和调控的研究进展,并探讨了这一研究领域亟待解决的关键问题和这些多能干细胞的应用前景。     

雷帕霉素促进胚胎干细胞向心肌细胞分化

目的 雷帕霉素是小分子mTOR抑制剂,可激活细胞自噬.本研究检测了雷帕霉素对胚胎干细胞(ES细胞)向心肌分化的影响.方法 采用拟胚体(embryoid body,EB)加抗坏血酸诱导ES细胞向心肌分化.悬浮诱导阶段添加自噬激动剂雷帕霉素或抑制剂羟氯喹,通过免疫印迹检测LC3蛋白剪切以监测细胞自噬水平,通过检测EB球的心...     

人诱导多能干细胞与人胚胎干细胞分化过程中Oct4/Nanog基因表达的比较

目的：比较通过慢病毒方法获得的人诱导多能性干细胞（iPSCs）与人胚胎干细胞（hESCs）分化过程中全能性基因Oct4、Nanog的表达变化。方法：收集分化不同时间点的拟胚体（EBs）,检测三胚层分化基因以及全能性基因Oct4/Nanog的表达,并通过畸胎瘤组织切片的荧光染色分析Oct4的表达。结果：iPSCs获得的EB中内外三胚层分化基因表达的出现明显晚于hESCs来源的EB。不同于hESCs,iPSCs悬浮培养获得的EBs在体外培养18天未见内源性Oct4、Nanog基因表达的下调。未分化的iPSCs注射严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠培养10周后获得的畸胎瘤中仍存在Oct4阳性的细胞,但iPS-#2中明显少于iPS-#5。结论：通过慢病毒方法获得的iPSCs虽然具有向三胚层分化的能力,但在分化过程中仍维持较高水平的全能性基因Oct4、Nanog的表达。     

间充质干细胞分化为心肌细胞的诱导方法研究进展

间充质干细胞作为一种取材方便、易于分离培养、体外扩增快、免疫原性低的成体干细胞,具有自我更新和多向分化潜能,可在体内外不同的诱导条件下分化为心肌细胞,是理想的心肌再生治疗的种子细胞。本文综述了间充质干细胞分化为心肌细胞的诱导方法,包括化学试剂、中药制剂、机械力和电磁刺激、心肌环境因子、损伤组织条件培养、组织工程方法等,为其在心肌损伤性疾病尤其是心肌梗死治疗中的应用提供基础。     

Production of Mouse Embryoid Bodies with Hepatic Differentiation Potential by Stirred Tank Bioreactor

Embryonic stem (ES) cells can differentiate into functional hepatic lineage cells, which can potentially be used in biomedicine. To obtain hepatic lineage cells from ES cells, embryoid bodies (EBs) must be formed. In this study, we developed an EB formation system using a spinner flask for mass production of EBs. ES cells were inoculated into the spinner flask, where they formed EBs within 4 d. The EBs were then transferred into an attached culture for hepatic differentiation. To verify the hepatic lineage cells, albumin secretion and hepatic-specific gene expression were examined. We found that EBs formed by either the spinner flask or hanging drops exhibited similar albumin secretion potential and hepatic-specific gene expression. We conclude that the spinner flask method can be used to produce mouse EBs that can be used to mass produce hepatic lineage cells for use in biomedicine.     

Embryoid body formation from embryonic and induced pluripotent stem cells: Benefits of bioreactors

Embryonic stem (ES) cells have the ability to differentiate into all germ layers, holding great promise not only for a model of early embryonic development but also for a robust cell source for cell-replacement therapies and for drug screening. Embryoid body (EB) formation from ES cells is a common method for producing different cell lineages for further applications. However, conventional techniques such as hanging drop or static suspension culture are either inherently incapable of large scale production or exhibit limited control over cell aggregation during EB formation and subsequent EB aggregation. For standardized mass EB production, a well defined scale-up platform is necessary. Recently, novel scenario methods of EB formation in hydrodynamic conditions created by bioreactor culture systems using stirred suspension systems (spinner flasks), rotating cell culture system and rotary orbital culture have allowed large-scale EB formation. Their use allows for continuous monitoring and control of the physical and chemical environment which is difficult to achieve by traditional methods. This review summarizes the current state of production of EBs derived from pluripotent cells in various culture systems. Furthermore, an overview of high quality EB formation strategies coupled with systems for in vitro differentiation into various cell types to be applied in cell replacement therapy is provided in this review. Recently, new insights in induced pluripotent stem (iPS) cell technology showed that differentiation and lineage commitment are not irreversible processes and this has opened new avenues in stem cell research. These cells are equivalent to ES cells in terms of both self-renewal and differentiation capacity. Hence, culture systems for expansion and differentiation of iPS cells can also apply methodologies developed with ES cells, although direct evidence of their use for iPS cells is still limited.     

定向诱导小鼠ES细胞向心肌细胞的分化

为了提高体外诱导ES细胞向心肌细胞分化的效率 ,对以往的诱导方法加以改进 ,采用直接悬浮培养和 0 8%DMSO诱导 ,建立了简便、高效的定向诱导ES细胞向心肌细胞分化的体系 .诱导第 9d起可见自发性、有节律跳动的类胚体出现 ,第 14d达到高峰 ,约有 70 %的拟胚体产生跳动 .用RT PCR的方法在跳动的拟胚体中检测到心肌细胞特异性标志物的表达 ,采用免疫荧光染色的方法在蛋白水平检测到心肌特异的α辅肌动蛋白 (α actinin)的表达 ,并可见清晰肌小节 ,表明在改进的体外诱导条件下ES细胞可分化为成熟的心肌细胞 .     

人胚胎干细胞传代培养及细胞化学染色特性

目的 体外建立人胚胎干细胞传代培养方法,研究人胚胎干细胞细胞化学染色特性.方法 以小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层传代培养人胚胎干细胞,检测人胚胎干细胞、自发分化克隆及拟胚体的细胞化学染色特性.结果 人胚胎干细胞在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上传30代以上其形态保持不变;人胚胎十细胞碱性磷酸酶、过碘酸-雪夫反应、α-醋酸萘酚酯酶染色阳性,自发分化克隆细胞阳性程度明显减弱;人胚胎干细胞形成的拟胚体碱性磷酸酶染色弱阳性,过碘酸-雪夫反应、α-醋酸萘酚酯酶染色阳性.结论 小鼠胚胎成纤维细胞能支持人胚胎干细胞传代培养,细胞化学染色结果能初步鉴别人胚胎干细胞未分化特性.