猪流行性腹泻病毒经其附属蛋白抑制细胞凋亡

【背景】orf3位于猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV) s基因与e基因之间,是目前发现的PEDV唯一一个附属基因,编码附属蛋白(ORF3蛋白)。我们前期研究初步发现ORF3蛋白对PEDV诱导的细胞凋亡有影响。【目的】研究ORF3蛋白在PEDV侵染复制过程中的毒力作用机制。【方法】实验用3种PEDV:rDR13att-?ORF3 (orf3基因全部敲除)、DR13-ORF3att (携带有C端截短orf3)、rDR13att-ORF3wt(携带全长orf3基因)感染Vero细胞,观察病变情况,再用活细胞成像仪、流式细胞仪、 DNA断裂的原位末端标记法[terminaldeoxynucleotidyltransferase(TDT)-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL]等方法检测不同感染时间点的细胞凋亡情况,然后用蛋白质印迹方法分析PEDV感染宿主细胞中主要凋亡相关蛋白(如Caspase-3)的活化或裂解,最后进行转录组测序研究病毒感染细胞中差异基因的表达情况,再用荧光定量PCR验证转录组结果。【结果】rDR13att-?ORF3引起较多的细胞病变,活细胞成像仪的动态观察结果显示,3种病毒侵染的细胞凋亡水平随着时间的延长均高于正常阴性细胞,但敲除orf3的病毒感染细胞后细胞凋亡率比其他两种病毒更高;敲除orf3病毒感染细胞凋亡率显著高于其他两种病毒;病毒rDR13att-?ORF3感染细胞后TUNEL阳性细胞数比DR13-ORF3att和rDR13att-ORF3wt更多;表达ORF3蛋白的重组PEDV可以抑制Caspase-3的活化;ORF3蛋白对受感染细胞Heat shock 70 kD protein 1B (HSP70)基因转录有促进作用,荧光定量PCR结果表明rDR13att-ORF3wt感染细胞的HSP70表达量高于rDR13att-?ORF3感染细胞。【结论】PEDV通过ORF3蛋白抑制细胞凋亡,而且这种作用可能是通过抑制Caspase-3的活化或增加HSP70的产生来完成的。     

猪流行性腹泻病毒分子生物学特征

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是以水泻、呕吐和脱水为特征的一种急性病毒性腹泻.猪流行性腹泻现已成为世界范围内的猪病之一.猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是PED的致病因子,是导致类似猪传染性胃肠炎(porcine transmissible gastroenteritis,TGE)临床症状的真正病原.迄今为止已发现PEDV与TGEV[1]、PEDV与PCV混合感染猪[2].已有用蛋黄IgY 预防PED效果的报道[3],还有用弱化的PEDV疫苗对仔猪进行免疫的报道[4],但都对其作用机制未作深入探讨.弄清PEDV的分子生物学特征,针对PED进行特异性免疫,必将对PED的诊断、治疗和综合防治产生深远影响.本文仅就PEDV的分子生物学特征作一综述.     

猪流行性腹泻病毒分子生物学特征

猪流行性腹泻 (ｐｏｒｃｉｎｅｅｐｉｄｅｍｉｃｄｉａｒｒｈｅａ ,ＰＥＤ)是以水泻、呕吐和脱水为特征的一种急性病毒性腹泻。猪流行性腹泻现已成为世界范围内的猪病之一。猪流行性腹泻病毒 (Ｐｏｒｃｉｎｅｅｐｉｄｅｍｉｃｄｉａｒｒｈｅａｖｉｒｕｓ ,ＰＥＤＶ)是ＰＥＤ的致病因子 ,是导致类似猪传染性胃肠炎 (ｐｏｒｃｉｎｅｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ ,ＴＧＥ)临床症状的真正病原。迄今为止已发现ＰＥＤＶ与ＴＧＥＶ[1] 、ＰＥＤＶ与ＰＣＶ混合感染猪[2 ] 。已有用蛋黄ＩｇＹ预防ＰＥＤ效果的报道[3] …     

猪流行性腹泻病毒ORF3蛋白40–91 aa是其细胞质定位的关键结构域

ORF3蛋白是猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)基因组编码的唯一的辅助蛋白,与病毒毒力相关。为确定PEDV ORF3细胞质定位信号,文中构建了系列PEDV DR13wt ORF3蛋白全长或截短肽重组表达载体,转染Vero细胞并利用激光共聚焦显微镜分析与EGFP融合表达的全长ORF3蛋白和其系列截短肽在细胞内的分布。结果表明,全长ORF3蛋白或所有包含2个跨膜域的40–91 aa基序的ORF3截短肽均只定位于细胞质中,而不包含40–91aa基序的ORF3截短肽分布于整个细胞中(细胞质和细胞核均有分布)。这表明40–91 aa是猪流行性腹泻病毒ORF3蛋白细胞质定位的关键结构域。PEDVORF3蛋白细胞质定位结构域的明确为进一步研究其细胞内转运和生物学功能提供了参考。     

猪流行性腹泻病毒免疫及疫苗研制

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是严重危害我国和世界养猪业的重要动物疫病,其致病原为猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV),属冠状病毒科α冠状病毒属.文中综述分为5个部分.前两部分在介绍该病病原及其流行病学的基础上先概括了初...     

HMCES蛋白促进猪流行性腹泻病毒在Vero细胞中的复制

【目的】鉴定能够调控猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)复制的关键宿主蛋白。【方法】利用LC-MS/MS技术结合串联质谱标签(tandem mass tag,TMT)，分析PEDV感染Vero细胞36 h后和未感染组的蛋白组学差异。鉴定筛选了114个显著差异表达蛋白，其中宿主胚胎干细胞特异性5-羟甲基胞嘧啶结合蛋白(5-hydroxymethylcytosine binding,ES cell-specific protein,HMCES)显著上调。进一步构建HMCES真核表达质粒，通过蛋白免疫印迹和实时荧光定量PCR检测过表达HMCES对PEDV复制的影响；合成针对HMCES基因的特异性si RNA，利用Western blotting和RT-q PCR检测si RNA对HMCES表达的干扰效果及HMCES被干扰后对PEDV复制的影响。【结果】过表达HMCES能显著促进PEDV在Vero细胞中复制，并且复制水平随着HMCES的剂量递增呈现剂量依赖式增加；si RNA-341下调内源性HMCES表达进而抑制PEDV复制。【结论】H...     

猪流行性腹泻病毒功能性受体的鉴定

为研究猪氨基肽酶(Porcine Aminopeptidase N,pAPN)是否作为猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的细胞感染受体,通过转染技术,使PEDV非容许性细胞MDCK表达pAPN,并用PEDV感染转染细胞。结果发现转染的MDCK细胞可以感染PEDV,并且该病毒可以在转染细胞中连续传代。免疫荧光法鉴定存在病毒抗原。进一步实验证实,抗pAPN血清可以抑制PEDV感染转染的MDCK细胞。这些结果展示转染的MDCK细胞、pAPN表达及PEDV病毒复制之间存在直接联系,证明pAPN是PEDV的细胞感染受体之一。     

猪流行性腹泻病毒S2截短肽的原核表达及其线性B细胞表位区鉴定

【背景】由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的猪流行性腹泻给养猪业造成了巨大的经济损失。PEDV S蛋白可以诱导宿主产生中和抗体。【目的】原核表达PEDV CV777疫苗株S2截短肽(aa:961-1 382)并制备其多克隆抗体;鉴定表达的S2截短肽上的线性B细胞表位区。【方法】将经密码子优化的PEDV S2截短肽编码DNA (s2t)克隆至载体p ET-28a中并转化Escherichia coli BL21(DE3),利用IPTG诱导S2截短肽表达。以经SDS-PAGE切胶纯化的重组S2截短肽免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。在E. coli BL21中GST融合表达覆盖S2截短肽序列全长、彼此重叠8个氨基酸残基的系列16肽。以制备的抗S2截短肽兔血清为一抗,通过Westernblot(WB)筛选系列16肽中的阳性反应性16肽,鉴定S2截短肽上的线性B细胞表位区。【结果】重组PEDV S2截短肽的相对分子质量约为50 kD;诱导4 h表达量最高,且主要形成包涵体。WB结果显示,纯化的S2截短肽能被猪抗PEDV血清识别;以纯化的S2截短肽免疫新西兰大白兔制备多抗血清,ELISA法检测抗体效价位于1:25 600-1:102 400之间。免疫组化和间接免疫荧光分析均表明,制备的多抗血清可以识别Vero细胞培养的PEDV DR13弱毒株。以制备的多抗血清通过WB从52个GST融合表达的16肽中鉴定到11个阳性反应性16肽。WB分析显示,得到的阳性反应性16肽都可以被猪抗PEDV血清识别。鉴定到的阳性16肽在S2截短肽上形成4个线性B细胞表位区(aa:969-984;1 065-1 096;1 225-1 280;1 361-1 382)。【结论】高效价抗PEDV S2截短肽多克隆抗体的制备和S2截短肽上线性B细胞抗原表位区的确定有助于了解S蛋白的结构与功能,为建立有效的PEDV检测方法奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒嵌套式RT-PCR检测方法的建立

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的一种以呕吐、腹泻和失水为特征的猪肠道传染病.各种年龄的猪都可发病[1],哺乳仔猪、架子猪或育肥猪的发病率最高可达100%,尤其哺乳仔猪的受害最严重.本病在欧洲许多国家均有报道.上海畜牧兽医研究所等单位证实,我国近年来发生的仔猪腹泻,有很多为PEDV引起.     

Expression of neutralizing epitope of porcine epidemic diarrhea virus in potato plants

Transgenic plants expressing recombinant proteins from pathogenic microorganisms provide an inexpensive edible vaccine for induction of local immunity. A neutralizing epitope of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) gene containing SEKDEL was expressed in potato using Agrobacterium-mediated transformation system. Putative transgenic plants were regenerated, and genomic PCR confirmed the presence of PEDV epitope gene in the potato plants. Based on the ELISA results, epitope of PEDV protein made up approximately 0.1% of the total soluble tuber protein.     

Genome-wide transcriptome analysis of porcine epidemic diarrhea virus virulent or avirulent strain-infected porcine small intestinal epithelial cells

Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) is the main cause of diarrhea, vomiting, and mortality in pigs, which results in devastating economic loss to the pig industry around the globe. In recent years, the advent of RNA-sequencing technologies has led to delineate host responses at late stages of PEDV infection; however, the comparative analysis of host responses to early-stage infection of virulent and avirulent PEDV strains is currently unknown. Here, using the BGI DNBSEQ RNA-sequencing, we performed global gene expression profiles of pig intestinal epithelial cells infected with virulent (GDS01) or avirulent (HX) PEDV strains for 3, 6, and 12 h. It was observed that over half of all significantly dysregulated genes in both infection groups exhibited a down-regulated expression pattern. Functional enrichment analyses indicated that the differentially expressed genes (DEGs) in the GDS01 group were predominantly related to autophagy and apoptosis, whereas the genes showing the differential expression in the HX group were strongly enriched in immune responses/inflammation. Among the DEGs, the functional association of TLR3 and IFIT2 genes with the HX and GDS01 strains replication was experimentally validated by TLR3 inhibition and IFIT2 overexpression systems in cultured cells. TLR3 expression was found to inhibit HX strain, but not GDS01 strain, replication by enhancing the IFIT2 expression in infected cells. In conclusion, our study highlights similarities and differences in gene expression patterns and cellular processes/pathways altered at the early-stage infection of PEDV virulent and avirulent strains. These findings may provide a foundation for establishing novel therapies to control PEDV infection.     

表达猪流行性腹泻病毒S1基因植物乳酸杆菌工程菌的免疫原性分析

为探究表达猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)S1基因的植物乳杆菌工程菌是否对动物产生保护力,利用构建的含重组质粒pVE5523-S1乳杆菌口服免疫豚鼠3次,每次间隔14d,每次2×108 CFU/只.并以植物乳杆菌及含表达质粒pVE5523植物乳杆菌为阴性对照,...     

猪流行性腹泻病毒S蛋白胞内区线性B细胞表位最小基序鉴定

【背景】S蛋白是猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)的主要结构蛋白和免疫原性蛋白,在前期的研究中,本课题组在S蛋白的胞内区鉴定到2个包含线性B细胞表位的短肽。【目的】鉴定PEDV S蛋白胞内区线性B细胞表位的最小基序。【方法】原核表达2个短肽的每次后移1个氨基酸的系列8肽,以兔抗S蛋白血清为一抗,通过Western Blot筛选阳性反应8肽,鉴定S蛋白胞内区线性B细胞表位的最小基序。【结果】S蛋白胞内区的2个包含线性B细胞表位的短肽共享一个表位,该表位的最小基序为¹³⁷¹QPYE¹³⁷⁴。同源性分析显示该B细胞表位基序为保守性表位。【结论】确定了S蛋白胞内区线性B细胞表位的最小基序为¹³⁷¹QPYE¹³⁷⁴;S蛋白抗原表位的鉴定有助于提高对其结构和功能的理解。     

Proteome analysis of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV)‐infected Vero cells

Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) causes an acute, highly contagious, and devastating viral enteric disease with a high mortality rate in suckling pigs. A large‐scale outbreak of PED occurred in China in 2010, with PEDV emerging in the United States in 2013 and spreading rapidly, posing significant economic and public health concerns. In this study, LC–MS/MS coupled to iTRAQ labeling was used to quantitatively identify differentially expressed cellular proteins in PEDV‐infected Vero cells. We identified 49 differentially expressed cellular proteins, of which 8 were upregulated and 41 downregulated. These differentially expressed proteins were involved in apoptosis, signal transduction, and stress responses. Based on these differentially expressed proteins, we propose that PEDV might utilize apoptosis and extracellular signal regulated kinases pathways for maximum viral replication. Our study is the first attempt to analyze the protein profile of PEDV‐infected cells by quantitative proteomics, and we believe our findings provide valuable information with respect to better understanding the host response to PEDV infection.     

一种基于猪流行性腹泻病毒S1蛋白的单域抗体的阻断ELISA方法及其评价

文中旨在利用猪流行性腹泻病毒 (Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV) S1蛋白生物素化纳米抗体建立一种阻断酶联免疫吸附试验 (Blocking enzyme-linked immunosorbent assay,bELISA) 方法,用于检测猪体内PEDV抗体水平及疫苗免疫效果的评估。对PEDV S1蛋白的特异性单域抗体 (Single-domain antibodies,sdAb) sdAb3基因进行扩增,并在3′端融合Avitag序列,构建至原核表达载体pET21b,进行sdAb3-Avitag蛋白诱导表达纯化。对纯化的sdAb3-Avitag融合蛋白进行生物素标记并鉴定其活性。以PEDV重组S1蛋白为抗原,通过对各反应条件进行摸索与优化,建立一种可靠灵敏的bELISA方法应用于血清样品检测,并与商品化试剂盒检测进行比价。成功构建重组载体pET21b-sdAb3-Avitag并诱导表达出sdAb3-Avitag蛋白。体外生物素标记的sdAb3 (sdAb3-Biotin) 具有良好的活性。所构建的bELISA方法中,最适参数为：S1蛋白的包被浓度200 ng/孔;血清稀释比例1︰2,血清孵育时间2 h;sdAb3-Biotin稀释比1︰8 000,孵育时间30 min;酶标抗体稀释比例1︰5 000,反应时间30 min。所建立的方法与猪传染性胃肠炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等主要猪源病毒的阳性血清均无交叉反应,具有良好的特异性和重复性。利用建立的bELISA方法对临床54份猪血清样品进行检测,结果显示,该方法与商品化试剂盒检测结果具有92.56%的总体符合率。文中建立了一种省时可靠的bELISA方法,可用于PEDV的临床监测和疫苗免疫效果评估。