Hey1基因参与调控BMP9诱导的C3H10T1/2细胞成骨分化

目的:观察发状分裂相关增强子Hey1在骨形态发生蛋白9(BMP9)诱导的小鼠间充质干细胞(MSCs)C3H10T1/2成骨分化中的作用。方法:包装Hey1、BMP9以及GFP的过表达慢病毒,并分别作用于C3H10T1/2细胞,RT-PCR和Western blot检测Hey1、BMP9以及GFP的慢病毒是否包装成功,碱性磷酸酶(ALP)检测早期成骨指标ALP的变化,茜素红S染色检测晚期成骨指标钙盐沉积,MTT检测Hey1对BMP9调控的C3H10T1/2细胞增值的影响,流式细胞术检测Hey1对BMP9调控的C3H10T1/2细胞周期的影响。结果:Hey1、BMP9以及GFP的慢病毒包装成功;在成骨分化早期,过表达Hey1基因可促进BMP9调控的C3H10T1/2细胞的成骨分化与增殖;在成骨分化晚期,过表达Hey1基因可促进BMP9诱导的C3H10T1/2细胞的成骨分化,并将BMP9调控的C3H10T1/2细胞周期阻滞在G1期。结论:Hey1基因可参与调控BMP9诱导的小鼠C3H10T1/2细胞的早晚期成骨分化,并对细胞的增殖与周期有一定的影响。     

Hmox1促进BMP9诱导C3H10T1/2细胞向成骨分化

目的:研究血红素加氧酶1(hemeoxygenase 1,Hmox1)在骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic proteins 9,BMP9)诱导下间充质干细胞C3H10T1/2向成骨分化过程中发挥的作用。方法:用Ad-BMP9感染C3H10T1/2,分别用Q-PCR和Western blot检测Hmox1mRNA和蛋白水平的变化;Hmox1激动剂COPP处理BMP9诱导的C3H10T1/2细胞,碱性磷酸酶(ALP)染色和活性测定检测早期成骨指标ALP的变化;过表达Hmox1的重组腺病毒(Ad-Hmox1)处理BMP9诱导的C3H10T1/2细胞,ALP染色和活性测定早期成骨指标ALP,茜素红染色检测晚期成骨指标钙盐沉积,Western blot检测成骨相关基因COL1A1。结果:Ad-BMP9感染C3H10T1/2后,Hmox1的mRNA及蛋白水平均升高;BMP9与Hmox1激动剂COPP联用与BMP9组相比ALP的活性增强;Ad-Hmox1可以增强BMP9诱导下C3H10T1/2细胞的ALP活性和钙盐沉积,以及成骨相关基因COL1A1表达。结论:Hmox1可以促进BMP9诱导下C3H10T1/2细胞的成骨分化。     

过表达miR-155抑制BMP9诱导间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化

目的:研究过表达miR-155对BMP9诱导间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化的影响。方法:(1)用重组腺病毒Ad-BMP9(BMP9)诱导C3H10T1/2细胞成骨分化,定量PCR(qPCR)检测miR-155的表达,RT-PCR检测Runx2和ALP的表达。(2)miR-155和BMP9共同处理C3H10T1/2细胞,qPCR检测miR-155的表达,ALP活性和染色检测早期成骨能力。(3)miR-155和BMP9共同处理C3H10T1/2细胞,诱导分化14d茜素红S染色检测晚期成骨能力。(4)miR-155和BMP9共同处理C3H10T1/2细胞,qPCR检测成骨分化相关基因Runx2、OSX、COL1A1、ALP、OCN和OPN的表达。(5)miR-155和BMP9共同处理C3H10T1/2细胞,Western blot检测p-Smad1/5/8、OCN和OPN蛋白水平的表达。(6)qPCR和Western blot分别检测HIF1α和VEGF的mRNA表达水平和蛋白质表达水平。(7)应用荧光素酶报告基因对miR-155的靶基因进行筛选和验证。结果:在BMP9诱导C3H10T1/2细胞成骨分化过程中,过表达miR-155降低ALP活性及染色;减少钙盐沉积;成骨分化相关基因Runx2、OSX、COL1A1、ALP、OCN和OPN表达降低;抑制p-Smad1/5/8、OCN和OPN蛋白水平的表达;HIF1α和VEGF的mRNA和蛋白表达水平减少。在对靶基因的检测中,过表达miR-155可以抑制HIF1α蛋白水平的表达,但对其mRNA水平无明显影响。结论:miR-155过表达减弱BMP9诱导间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化,可能是通过抑制Smad/BMP信号通路发挥作用,也有可能是通过抑制靶基因HIF1α的表达来发挥作用。     

MiR-21协同BMP9促进间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化

目的:探讨miR-21与BMP9之间的关系,明确miR-21在BMP9诱导间充质干细胞成骨分化中的作用。方法:(1)Ad-BMP9感染C3H10T1/2细胞,Real-time-PCR检测miR-21表达。RT-PCR检测ALP的表达。(2)MiR-21转染C3H10T1/2细胞,Real-time-PCR检测miR-21和BMP9表达。(3)MiR-21和BMP9-CM处理C3H10 T1/2细胞,ALP活性和染色实验检测C3H10 T1/2细胞早期成骨能力。茜素红S染色实验检测钙盐沉积情况。(4)MiR-21和BMP9-CM处理C3H10 T1/2细胞,Real-time-PCR检测成骨分化相关因子ALP,OCN的表达。(5)MiR-21和BMP9-CM处理C3H10T1/2细胞,Western blot检测p-Smad1/5蛋白水平的表达。结果:(1)BMP9暂时降低miR-21的表达。MiR-21也可以暂时降低BMP9的表达。(2)MiR-21可以协同BMP9增强ALP和钙盐沉积。(3)MiR-21协同BMP9增加了p-Smad1/5蛋白水平的表达。结论:MiR-21与BMP9存在相互关系,两者可以互相调节表达。MiR-21可以协同BMP9促进间充质干细胞C3H10T1/2细胞成骨分化,这一过程与增强BMP9/Smad信号的激活程度有关。     

孤儿核受体SHP敲减抑制BMP9诱导C3H10T1/2细胞的成骨分化

孤儿核受体SHP(small heterodimer partner)是核受体超家族中的一员,具有LXXLL模体及配体结合域,但无经典的DNA结合域.它可与多种转录因子结合,调节细胞的增殖、分化和代谢等生物学过程.但目前关于SHP在BMP9诱导成骨分化中的确切作用却尚不清楚.本研究证明,SHP参与BMP9诱导的C3H10T1/2细胞成骨分化. RT-PCR结合Western印迹方法检测蛋白揭示,异位表达BMP9上调了SHP在C3H10T1/2细胞中的表达. 小干扰RNA敲减SHP基因在C3H10T1/2细胞的表达下调了成骨相关基因Runx2、Id1、Id2及CTGF的表达,而过表达BMP9则可上调这些基因的表达.碱性磷酸酶(ALP)活性测定/染色及茜素红染色显示,敲减核受体SHP基因可抑制BMP9的成骨分化作用,而过表达BMP9可部分消除SHP 敲减导致的成骨抑制作用.上述结果提示,核受体SHP为BMP9诱导的C3H10T1/2细胞成骨分化所必需. 究竟BMP9如何上调SHP基因表达,以及SHP究竟通过何种机制上调BMP9下游成骨分化相关基因的表达尚待进一步研究.     

Ⅲ型纤连蛋白组件包含蛋白5通过抑制ERK1/2磷酸化抑制C3H10T1/2细胞成脂分化

旨在探究Ⅲ型纤连蛋白组件包含蛋白5(type Ⅲ domain-containing protein5,FNDC5)对C3H10T1/2细胞成脂分化的调控作用.利用qRT-PCR和Western印迹检测FNDC5在C3H10T1/2细胞成脂分化过程中的时序性表达规律;构建慢病毒包被的过表达/干扰FNDC5载体,转染C3...     

MYOZ2通过负调控TCAP的表达促进C3H10T1/2细胞成脂分化

本研究旨在明确钙调磷酸酶肌小节结合蛋白2(myozenin2,MYOZ2)的组织表达特性,阐明其对C3H10T1/2细胞成脂分化的影响及可能的作用机制.采集180日龄马身猪、60日龄ICR小鼠、35日龄罗斯肉鸡和12月龄小尾寒羊背最长肌、皮下脂肪和肝组织,检测MYOZ2基因mRNA表达.结果 显示,MYOZ2基因在所检...     

p38蛋白激酶参与BMP9诱导的C3H10T1/2细胞成骨分化

目的:初步分析丝裂原活化蛋白激酶p38在BMP9诱导间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化过程中的作用.方法:利用BMP9重组腺病毒感染C3H10T1/2细胞,Western blot检测p38激酶总蛋白表达水平和磷酸化水平.p38的特异性抑制剂SB203580抑制p38活性或RNA干扰抑制p38表达后,分析ALP活性...     

DLX1对BMP9诱导的间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化的影响

目的:分析和确认转录因子DLX1在骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)诱导的间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化中的作用。方法:首先,BMP9腺病毒感染C3H10T1/2细胞,RT-PCR和Western blot检测DLX1表达变化;随后,利用重组腺病毒技术分别过表达DLX1和RNA干扰(RNA Intenference,RNAi)抑制DLX1的表达,并利用碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)染色、钙盐沉积实验(茜素红染色),免疫细胞化学检测骨钙素(osteocalcin,OCN)表达和裸鼠皮下异位成骨实验分析DLX1对于BMP9诱导的C3H10T1/2细胞成骨分化的影响。荧光素酶报告基因实验和Western blot分析DLX1对于BMP9诱导的C3H10T1/2细胞Smad1/5/8信号途径的影响。结果:BMP9可以促进C3H10T1/2细胞中DLX1基因和蛋白表达水平;过表达DLX1在体外可进一步促进BMP9诱导的C3H10T1/2细胞的ALP活性、钙盐沉积以及OCN的表达,过表达DLX1亦可促进BMP9诱导的裸鼠皮下异位成骨;反之,RNAi抑制DLX1表达后,由BMP9诱导的C3H10T1/2细胞的ALP活性、钙盐沉积、OCN表达和裸鼠皮下异位成骨均相应受到抑制。过表达DLX1可进一步增强BMP9诱导的C3H10T1/2细胞中Smad/1/5/8的转录调控活性,RNAi降低DLX1表达则可抑制BMP9诱导Smad/1/5/8的转录调控活性。但是,无论过表达DLX1和RNAi降低DLX1表达均不会对BMP9诱导的Smad/1/5/8磷酸化造成影响。结论:DLX1可以调节BMP9诱导的间充质干细胞C3H10T1/2细胞成骨分化,其调节作用可能是通过影响Smad1/5/8信号的转录调控活性而实现的。     

BMP9经JNK激酶途径调控间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化

为了证实JNK激酶在骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic proteins 9,BMP9) 诱导间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化中的作用,利用重组腺病毒将BMP9导入间充质干细胞C3H10T1/2. 通过碱性磷酸酶(ALP)活性测定、钙盐沉积实验、荧光素酶报告基因检测、Western印迹和组织化学染色等方法,检测BMP9是否可经JNK激酶途径调控间充质干细胞C3H10T1/2向成骨分化.动物实验验证在RNA沉默JNK蛋白激酶后,对BMP9诱导间充质干细胞C3H10T1/2向成骨分化的影响．结果发现,BMP9可以增强JNK 激酶的磷酸化;利用JNK抑制剂SP600125抑制JNK激酶活性后,BMP9诱导的间充质干细胞C3H10T1/2的早期成骨指标ALP活性和晚期指标钙盐沉积均受到抑制,而且经典SMAD信号的活化也相应受到抑制;RNA干扰沉默JNK基因表达后,同样也可抑制BMP9 诱导的C3H10T1/2细胞的ALP活性和裸鼠皮下异位成骨．因此表明,BMP9可活化JNK激酶途径从而诱导间充质干细胞C3H10T1/2向成骨分化．     

SAHA抑制间充质干细胞C3H10T1/2的增殖与成脂分化

本文研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂辛二酰苯胺异羟肟酸（suberoylanilide hydroxamic acid,SAHA）对间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs) C3H10T1/2增殖和成脂分化的影响及其可能的作用机制.用Western印迹验证SAHA对细胞内蛋白乙酰化的影响;用MTT和流式细胞术检测细胞活性和细胞周期;利用油红O染色检测细胞成脂分化,实时定量PCR检测PPARγ2和成脂分化标志物Fabp4、perilipin以及adipoq mRNA的转录.Western印迹结果显示,SAHA可促进细胞内蛋白的乙酰化.MTT和流式细胞术结果显示,SAHA对C3H10T1/2细胞活性的抑制呈浓度依赖性,随着SAHA浓度增加,细胞形态趋向于展平,并将细胞周期抑制在G0/G1期;SAHA可呈浓度依赖性抑制C3H10T1/2 细胞的成脂分化作用.同时实时定量PCR结果显示,SAHA抑制成脂关键转录因子PPARγ2,脂肪因子Fabp4、perilipin和adipoq mRNA的转录.综上所述,SAHA可影响间充质干细胞C3H10T1/2细胞形态,并呈剂量依赖性地抑制其增殖和成脂分化.