硫激酶在快速测定辅酶A中的应用

我们早在1960年试制辅酶A时,使用了磺胺酰化法测定其生物活力。但总觉此法操作麻烦,每一个样品都要绘制一条浓度测定曲线,从线上定出一个Lipmann单位所代表的实验重量,才能根据标准值折算成百分纯度。后来Le Van Hung作了部分改进,但测定仍很费时。1967年Abiko等认为此法专一性低,所得实验值不能正确代表它的     

用大肠杆菌磷酸转乙酰酶测定辅酶A

已报道的辅酶A(CoA)测定方法中,磺酰胺乙酰化法能按Lipmann的定义确定试样的含量单位,不需要标准品,但方法费时而且专一性较差;柠檬酸裂解酶法对CoA的专一性高,     

Neurospora Crassa RNase N_1的分离与纯化

前言前文报道了红色链孢霉核糖核酸酶N_1(N.Crassa RNase N_1)高产菌株的选育及其核糖核酸酶(RNase)作用碱基专一性的鉴定。本文主要介绍核糖核酸酶N_1的分离与纯化。我们在高井等人方法的基础上,作了某些改进。该方法有效地用于大量制备,并达到了较高的纯度。     

Neurospora Crassa RNase N_1的分离与纯化

前言前文报道了红色链孢霉核糖核酸酶N_1(N.Crassa RNase N_1)高产菌株的选育及其核糖核酸酶(RNase)作用碱基专一性的鉴定。本文主要介绍核糖核酸酶N_1的分离与纯化。我们在高井等人方法的基础上,作了某些改进。该方法有效地用于大量制备,并达到了较高的纯度。     

一种简易的制备和纯化质粒DNA的方法

近年来随着遗传工程的飞速发展,DNA重组技术被广泛应用,许多实验室在制备一定纯度、产量较高、方法简便的质粒DNA方面作了许多工作。国外大多数实验室普遍采用CsCl等密度梯度超离心法,但国内受仪器限制,应用较少。我们比较了PEG沉淀质粒DNA, 羟基磷灰石法制备质粒DNA,快速抽提质粒DNA,以及M.A.K柱制备质粒DNA等方法,它们都各有利弊。本实验室对L.P.Elwell的实验条件稍作改进,温和地制备清亮裂解液并抽提质粒DNA,然后应用Sephacryl S-1000作凝胶过滤,获得了纯度高、产量大,无染色体DNA     

NADP~ 在兔肌甘油醛3-磷酸脱氢酶中作为氢受体的活力

兔肌甘油醛-3-磷酸脱氢酶以NADP~ 作氢受体时,有极轻微的活力,实验表明它不是由于所用NADP~ 试剂中含有NAD~ 或酶制剂中含有磷酸酯酶、转氢酶等造成的干扰。采用高浓度酶对纯化后的NADP~ 测定结果是:NADP~ 作为氢受体的活力仅及NAD~ 的二百分之一。米氏常数K_m为700μm。NADP~ 对NAD~ 的还原无明显抑制作用。不同来源的甘油醛-3-磷酸脱氢酶对辅酶专一性程度有差别,酵母酶的专一性较兔肌酶为高:NADP~ 作为氢受体的活力仅为NAD~ 的千分之一。     

NADP~ 在兔肌甘油醛3-磷酸脱氢酶中作为氢受体的活力

兔肌甘油醛-3-磷酸脱氢酶以NADP~ 作氢受体时,有极轻微的活力,实验表明它不是由于所用NADP~ 试剂中含有NAD~ 或酶制剂中含有磷酸酯酶、转氢酶等造成的干扰。采用高浓度酶对纯化后的NADP~ 测定结果是:NADP~ 作为氢受体的活力仅及NAD~ 的二百分之一。米氏常数K_m为700μm。NADP~ 对NAD~ 的还原无明显抑制作用。不同来源的甘油醛-3-磷酸脱氢酶对辅酶专一性程度有差别,酵母酶的专一性较兔肌酶为高:NADP~ 作为氢受体的活力仅为NAD~ 的千分之一。     

乙酰辅酶A合成酶家族中保守的色氨酸残基的生化功能（英文）

甲烷菌与甲烷八叠球菌是仅有的两种已知利用乙酸盐进行甲烷生成的菌属。稻田以及厌氧的废物分解物是甲烷生物生成的主要来源。甲烷菌在自然界广泛分布,相比甲烷八叠球菌,在低乙酸盐的环境中对乙酸盐仍有高亲和力。在甲烷生成第一步即将乙酸盐转化为乙酰辅酶A的过程中,与甲烷八叠球菌利用乙酸激酶与磷酸转乙酰酶激活途径不同,甲烷菌通过腺嘌呤形成乙酰辅酶A合成酶进行催化。在甲烷菌一属(Methanosaeta concilii)中,共发现5个乙酰辅酶A合成酶的编码基因,其中3种乙酰辅酶A合成酶的生化及酶活特性已被确定。该3种乙酰辅酶A合成酶均以乙酸盐为其最优底物。尽管在短链乙酰辅酶A合成酶家族中,发现酰基底物结合位点高度保守,但乙酰辅酶A合成酶家族的酰基底物范围极为广泛。本研究对甲烷菌中不同种乙酰辅酶A合成酶的酰基底物结合位点的关键氨基酸进行识别与比较,从而对乙酰辅酶A合成酶家族的酶活特性有更全面深入的了解。首先,我们对甲烷菌一属中乙酰辅酶A合成酶4进行生化性质测定。结果表明,该酶无催化一系列酰基底物为酰基辅酶A或其中间产物酰基腺苷酸的活性。通过序列对比发现,嗜热自养甲烷杆菌的乙酰辅酶A合成酶1中高度保守的416位色氨酸残基在甲烷菌一属的乙酰辅酶A合成酶4中被替换成528位苯丙氨酸残基。将甲烷菌一属的乙酰辅酶A合成酶4中的528位苯丙氨酸残基点突变为色氨酸残基后,进行酶学性质测定,未检测到该突变体具有乙酰辅酶A/乙酰腺苷酸合成活性。我们进一步对嗜热自养甲烷杆菌的乙酰辅酶A合成酶1中的416位色氨酸残基点突变为苯丙氨酸残基,酶活性质结果显示,突变酶对于乙酸盐以及丙酸盐作为底物时的活性未有明显差异。然而,以丙酸盐为底物时,释放丙酰腺苷酸中间产物。该结果表明,热自养甲烷杆菌的乙酰辅酶A合成酶1对于底物乙酸盐或丙酸盐的催化作用不甚相同,苯丙氨酸中的苯甲酰环降低该酶保留中间产物丙酰腺苷酸,从而转化为丙酰辅酶A的能力。     

乙酰辅酶A合成酶家族中保守的色氨酸残基的生化功能（英文）北大核心CSCD

甲烷菌与甲烷八叠球菌是仅有的两种已知利用乙酸盐进行甲烷生成的菌属。稻田以及厌氧的废物分解物是甲烷生物生成的主要来源。甲烷菌在自然界广泛分布,相比甲烷八叠球菌,在低乙酸盐的环境中对乙酸盐仍有高亲和力。在甲烷生成第一步即将乙酸盐转化为乙酰辅酶A的过程中,与甲烷八叠球菌利用乙酸激酶与磷酸转乙酰酶激活途径不同,甲烷菌通过腺嘌呤形成乙酰辅酶A合成酶进行催化。在甲烷菌一属(Methanosaeta concilii)中,共发现5个乙酰辅酶A合成酶的编码基因,其中3种乙酰辅酶A合成酶的生化及酶活特性已被确定。该3种乙酰辅酶A合成酶均以乙酸盐为其最优底物。尽管在短链乙酰辅酶A合成酶家族中,发现酰基底物结合位点高度保守,但乙酰辅酶A合成酶家族的酰基底物范围极为广泛。本研究对甲烷菌中不同种乙酰辅酶A合成酶的酰基底物结合位点的关键氨基酸进行识别与比较,从而对乙酰辅酶A合成酶家族的酶活特性有更全面深入的了解。首先,我们对甲烷菌一属中乙酰辅酶A合成酶4进行生化性质测定。结果表明,该酶无催化一系列酰基底物为酰基辅酶A或其中间产物酰基腺苷酸的活性。通过序列对比发现,嗜热自养甲烷杆菌的乙酰辅酶A合成酶1中高度保守的416位色氨酸残基在甲烷菌一属的乙酰辅酶A合成酶4中被替换成528位苯丙氨酸残基。将甲烷菌一属的乙酰辅酶A合成酶4中的528位苯丙氨酸残基点突变为色氨酸残基后,进行酶学性质测定,未检测到该突变体具有乙酰辅酶A/乙酰腺苷酸合成活性。我们进一步对嗜热自养甲烷杆菌的乙酰辅酶A合成酶1中的416位色氨酸残基点突变为苯丙氨酸残基,酶活性质结果显示,突变酶对于乙酸盐以及丙酸盐作为底物时的活性未有明显差异。然而,以丙酸盐为底物时,释放丙酰腺苷酸中间产物。该结果表明,热自养甲烷杆菌的乙酰辅酶A合成酶1对于底物乙酸盐或丙酸盐的催化作用不甚相同,苯丙氨酸中的苯甲酰环降低该酶保留中间产物丙酰腺苷酸,从而转化为丙酰辅酶A的能力。     

影响固相酶制备和性质的因素

虽然早在1916年,Nelson等人已将蔗糖酶吸附在活性炭和氢氧化铝胶上,制备了第一个固相酶。但到五十年代,固相酶的研究才为人们所注意,到六十年代才迅速发展起来。近年来,发展了固定化微生物、固相化辅酶及其再生的方法。所研究的固相酶从较简单的水解     

梨黄粉蚜的调查方法

<正> 梨黄粉蚜Aphanostigma jakusuiense(Kishda)身体微小,喜欢荫蔽,常栖息梨果萼洼内。调查此虫,过去均采用削除萼片,而后以手持放大镜检视虫数的方法。但此法费工费时,准确性差,且不便操作等,极待改进。 我们通过几年实践,摸索出一种粘着调查法。现介绍于后,供参考。     

用Tip column法分离纯化mRNA

鉴于大多数真核生物的mRNA具有3′端poly(A)的特征,目前,分离mRNA广泛采田oligo(dT)纤维素层析法。尽管这一方法成熟可行,但存在以下问题;流速较慢;柱床易发生堵塞;操作费时;洗脱体积较大。常需先沉淀浓缩后才能进行后续实验(如cDNA合成);在制备少量mRNA时,回收率较低等。据此,我们对mRNA分离方法作了改良,利用oligo(dT)纤维素吸附mRNA容量大的特点,尽可能缩小层析柱床     

热稳定酯酰辅酶A合成酶的异源表达及酶学特性

【目的】为寻找能合成丙酰辅酶A和丁酰辅酶A等聚酮合成前体的生物催化剂,用体外酶学实验对一个酯酰辅酶A合成酶进行了表征。【方法】利用丙二酰辅酶A合成酶作为输入序列,通过BLAST程序在Caldicellulosiruptor owensensis OL的基因组中找到1个酯酰辅酶A合成酶基因。在大肠杆菌中进行了异源表达,并通过亲和层析进行纯化。底物谱、最适反应条件、稳定性和动力学参数通过体外酶学实验进行表征,而定点突变则用于活性中心的氨基酸残基的分析。【结果】该酶具有较好的底物宽泛性,可识别丙酸、丁酸、2-甲基丙酸、戊酸、3-甲基丁酸、2-甲基丁酸以及环己甲酸等一系列单酸。反应最适温度为30°C,最适p H为7.0。70°C保温8 h后仍有45%的活性残留,表明该酶相对比较稳定。通过活性中心3个位点的定点突变可以改变酶的底物特异性。【结论】C.owensensis OL来源的酯酰辅酶A合成酶是潜在的生物催化剂,可以用于聚酮前体的合成。     

新型辅酶依赖型立体选择性氧化还原酶性质的初步研究

为了进一步认识立体选择性转化用菌株近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)SYB-1的转化机理及其转化酶系的酶学特性,考察了该菌种来源的粗酶的辅酶依赖型及立体选择性,发现依赖于辅酶NADP ,该酶将(R)-苯基乙二醇氧化为β-羟基苯乙酮;而依赖于辅酶NADH,该酶不对称还原β-羟基苯乙酮为(S)-苯基乙二醇。在研究该粗酶酶学特性后发现该粗酶对5C的伯醇专一性较强;在包括仲醇和二元醇的手性醇中,对于二元醇的专一性较强;而在还原反应中对2-丁酮专一性较强。金属螯合剂及重金属离子会对该粗酶的活力产生抑制作用。该粗酶催化氧化的最适pH为8.0,最适温度为50℃;催化还原的最适pH为6．0,最适温度为40℃。     

一种用于植物树胶酶产生菌筛选和酶学研究的不溶性产色底物

筛选产生植物树胶酶、特别是耐高温的植物树胶酶的微生物菌株,对采油工业有很大的实用意义。测定粘度变化或单糖含量的筛选方法,或则费时,或则专一性不强,需要探索更好的方法。一些多聚物如淀粉、纤维素、甲壳质,葡聚     

抗生素效价测定实验的几点改进

抗生素效价测定是本科实验教学中常见的实验,但目前常用实验步骤复杂,影响实验结果的因素多,造成实验重复性不高。针对这一问题,参照有关文献从制备菌悬液、制备上层培养基菌层、抑菌圈打孔方法和抗生素加注几个方面进行改进。结果表明改进后的方法操作简便,重复性好,收到了良好的实验教学效果。     

烟草Rubisco活化酶的纯化及其特性

利用35％饱和硫酸铵分部、DEAE－Sephacel和FPIC－MonoQ柱层析等步骤从烟草叶片中纯化了Rubisco活化酶,并制备了其专一性抗体。此法不仅快速,而且比活力高。以往认为菠菜和拟南芥Rubisco活化酶由两种亚基组成。通过快速制备的粗提液分析．发现烟草Rubisco活化酶由一种42kD的亚基组成。即使在有多种蛋白酶抑制剂存在的情况下,此亚基仍很易降解为39kD的亚基。ATP不仅对酶的活性所必需,而且也有利于维持酶的稳定性。该酶的热稳定性远比Rubisco差。     

利用Ⅲ型聚酮合酶CsyB起始单元的底物多样性体内合成csypyrone类化合物

作为新型Ⅲ型聚酮合酶,米曲霉来源的CsyB能够依次接受一个起始单元为短链脂肪酰辅酶A、一个延伸单元为丙二酰辅酶A和另一个延伸单元为乙酰乙酰辅酶A的3个底物形成短链的csypyrone B1-3。基于CsyB的晶体结构分析,显示它的活性中心存在一个长约16?的能够接受脂肪酰辅酶A结合通道,这个通道很可能能够接受多种底物。为了检测该酶的底物多样性,将CsyB基因导入到存在长链脂肪酰辅酶A前体的大肠杆菌中表达。高效液相结果显示,相比对照菌株,重组菌株产生了一系列长链的csypyrone衍生物。利用紫外可见光特征吸收值和高分辨液相色谱-质谱联用仪对这些新产物作了初步分析。对3个具有羟基的csypyrone产物的结构进行了核磁共振一维谱和二维谱的详细鉴定,确定了其羟基的位置。上述结果显示,CsyB具有广泛的底物特异性,不但可以接受多种长链饱和或不饱和脂肪酰辅酶A,还可以接受具有羟基修饰的长链脂肪酰辅酶A作为底物。     

改良质粒快提法及其在酶切检查中的应用

基因重组后,从转化的细菌中快速提取小量质粒作限制性酶切检查,以筛选出阳性克隆,现已或为分子生物学实验的一项常用技术,至今已建立了多种方法。目前常用的为碱法和煮沸法。虽然现今所用的最新方法比传统的方法大大简化,但仍然相当耗时,即使是一个熟练的技术人员,提取获得18—24个样品仍需约2.5—3小时,这还不包括酶切、电泳等步骤。此文介绍我们改良的快提法,此法可在10分钟之内迅速有效地提取质粒,结合改进随后的酶切、电泳等过程,即可在三小时内筛选18个样品。     

从国内现有菌株制备磷酸转乙酰酶

磷酸转乙酰酶(PTA),最早由Stadtman用克氏梭状孢子杆菌制备,但菌体培养烦难。1967年和1970年,Abiko报道了由大肠杆菌B制备PTA,并用以测定辅酶A。我们在Abiko工作的基础上,用大肠杆菌1.505制备PTA,获得较好的结果。大肠杆菌1.505菌种,是由中国科学院微生物研究所提供的。菌体培养条件如下:斜面培养基的成分是:1％蛋白胨,0.5％氯化钠,2％琼脂加蒸馏水至1,000毫升,趁热用绢布或纱布过滤分装,121℃,15磅灭菌30分钟,在无菌操作下将大肠杆菌1.505-环接种到斜面培养基上,37℃培养15小时。种子培养基的成分是1％葡