原核生物核糖核酸酶HII基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

核糖核酸酶HII (RNaseHII)能有效降解RNA和DNA杂交链中的RNA链。为进一步研究其功能 ,利用大肠杆菌XL1blue为模板 ,相应的寡聚脱氧核苷酸为引物 ,PCR扩增大肠杆菌RNaseHII(rnh 2 )基因 ,并将目的基因连接到克隆载体 pUC18上 ,经测序确认无误 ,分别亚克隆到能够进行IPTG诱导的表达载体pTrcHisC和进行温度诱导的表达载体pBV2 2 0上。重组质粒转化到大肠杆菌DH5α细胞中获得高效表达。在载体pTrcHisC和 pBV2 2 0中目的蛋白RNaseHII的表达量均超过菌体总蛋白的 2 0 % ,且表达产物以稳定的包涵体形式存在。此项工作为以后目的蛋白的纯化提供了有利条件 ,并为研究其结构和功能奠定了基础。     

天冬氨酸酶E.coli融合表达研究

以大肠杆菌基因组DNA为模板,设计引物扩增得到天冬氨酸酶基因,将其重组于胞内融合表达型T载体中,重组质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)。SDS-PAGE分析表明,工程菌经IPTG诱导,表达大量表观分子量约75kD的融合蛋白。经试验,工程菌细胞具有较高的天冬氨酸酶活性,融合形式的酶最适温度37℃,最适pH8.5,融合伴侣DsbA的存在对酶活没有影响。     

乳酸乳球菌苹果酸-乳酸酶基因的克隆

用酚抽提的方法提取乳酸乳球菌的基因组DNA,利用PCR方法从乳酸菌的基因组DNA中扩增出含有苹果酸-乳酸酶基因(malolactic enzyme gene,mle)的约1.6kb的DNA片断,用1%的琼脂糖凝胶分离扩增的片断,用试剂盒回收目的基因。将回收的目的基因与pGEM-T载体连接构建mle-T载体并转化大肠杆菌DH5a,挑取阳性克隆(白色菌落),酶切鉴定并测序。SalI酶切mle-T,回收mle DNA片断,与表达载体pET-28a载体连接,构建细菌Escherichia coli表达载体。     

棘孢木霉几丁质酶tachi2 基因的原核表达及酶学性质研究

目的:实现棘孢木霉(Trichoderma asperellum)几丁质酶基因tachi2的原核高效表达,研究几丁质酶Tachi2的酶学性质.方法:利用PCR技术扩增得到几丁质酶基因tachi2,将其克隆到原核表达载体pEHISTEV中,测序后,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后进行Tachi2蛋白的纯化和复性.用纯化的目的蛋白Tachi2进行几丁质酶酶学性质的研究.结果:tachi2基因在重组大肠杆菌中正确表达,其主要以包涵体形式存在;重组蛋白Tachi2分子量约为44kDa,经过纯化和复性后得到的Tachi2有较高的几丁质酶活性.该酶的最适温度为40℃,最适pH值为7.0,几丁质酶在40℃以下比较稳定、pH 6～9时酶有较高活性,受Cu2和Zn2+的强烈抑制.结论:成功实现了棘孢木霉几丁质酶基因tachi2的原核高效表达,表达纯化了重组蛋白,明确了几丁质酶Tachi2的酶学性质,为该几丁质酶的进一步开发利用和深入研究奠定了基础.     

Thermus thermophilus HB27锰过氧化氢酶在大肠杆菌中的表达及酶学性质分析

碱性嗜热过氧化氢酶是一种重要的纺织用酶。根据大肠杆菌密码子使用偏爱性,对Thermus thermophilus HB27来源的含锰过氧化氢酶基因进行密码子优化,将优化后的基因连接至表达载体pET28a(+)上,转化到E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达。结果表明在含有14mmol/L Mn2+浓度的培养液中以0.2 mmol/L的IPTG 42℃条件下诱导2 h的情况下,菌体破碎上清液中的酶活力可达25 U/ml。利用Ni亲和层析柱对该Mn-CAT进行纯化,酶学性质研究表明:此酶的最适温度为70℃,最适pH为pH 10.0,在80℃保温2 h,酶活力不损失;pH9.0~11.0的环境中放置2 h后,酶活仅损失约10%,此酶具有良好的工业开发潜力。     

单宁酶基因在黑曲霉ST31中的克隆与表达

利用PCR扩增得到米曲霉(Aspergillusoryzae)单宁酶(tannase)基因的编码序列,经DNA测序证实单宁酶基因已成功克隆,然后将其连接到黑曲霉的表达载体ANED2-SP2上构建单宁酶基因表达载体。将构建好的单宁酶基因表达载体通过原生质转化法导入黑曲霉菌株ST31中进行表达研究。结果表明重组菌株的单宁酶活力最高为104.02U/ml发酵液,比原始出发菌株米曲霉提高2~3倍。研究构建了黑曲霉的高效转化体系,提高了黑曲霉表达系统的应用水平,为其它新酶的研究提供有价值的参考。     

嗜热栖热菌α-葡萄糖苷酶基因的表达及酶学性质研究

用PCR方法从嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)HB27中扩增出编码α-葡萄糖苷酶基因hbg,将其克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pET28a( )上,电击转化E.coliBL21(DE3),获得高效表达hbg基因的大肠杆菌重组菌。重组菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测表达蛋白相对分子质量约为59kD,与预期分子量相符。经镍柱和阴离子交换柱纯化的重组表达的α-葡萄糖苷酶HBG最适温度为95℃,最适pH值为5.0。     

嗜热厌氧乙醇杆菌α-葡萄糖苷酶基因的表达及酶学性质的研究

用PCR方法从嗜热厌氧乙醇杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)JW200中扩增出编码a-葡萄糖苷酶的基因,将其克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pTrc99A上并获得表达a-葡萄糖苷酶的大肠杆菌重组菌。重组菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测出蛋白相对分子量约89kDa,经阴离子交换层析和凝胶层析纯化后的a-葡萄糖苷酶最适反应温度为70℃,最适反应pH为5～5.5,且在pH 5.5～6.5之间有较高的稳定性。重组a-葡萄糖苷酶在70℃下105 min后酶活仍达到80%。     

短短芽孢杆菌几丁质酶BBChi4基因的原核表达及抑菌活性研究

采用生物信息学方法分析短短芽孢杆菌GZDF3菌株几丁质酶BBChi4基因,以GZDF3菌株全基因组DNA为模版设计特异性引物,通过PCR扩增出BBChi4基因的全序列并对其测序验证。将测序验证无误的基因序列连接到原核表达载体(pET-28a),构建重组表达载体pET-28a-BBchi4,转入大肠杆菌BL21进行诱导表达,利用打孔法对诱导表达产物进行抑菌活性研究。生物信息学分析显示BBChi4基因全长为2 181 bp,编码726个氨基酸,分子量大小为77.69 kD,等电点为4.83,属于酸性几丁质酶。破碎重组表达菌体上清液SDS-PAGE电泳显示,重组蛋白质分子量大约为78 kD,与生物信息学预测结果一致。诱导表达最佳参数为1 mmol/L IPTG,30℃诱导4 h。破碎重组表达菌体上清液对半夏致病真菌(尖孢镰刀菌)有较强的拮抗作用。重组表达载体pET-28a-BBchi4的成功构建及表达为深入研究几丁质酶的功能提供科学依据。     

地衣芽孢杆菌普鲁兰酶编码基因的鉴定

对地衣芽孢杆菌基因组序列分析显示。其中标注为amyX的基因可能编码普鲁兰酶。以PCR方法,从地衣芽孢杆菌染色体DNA中扩增出amyX基因蛋白编码区,插入大肠杆菌表达载体pET28aT7启动予下游。含重组质粒的大肠杆菌BL21（DE3）在IPTG诱导下表达出有活性的普鲁兰酶。酶学性质初步分析表明,重组普鲁兰酶最适反应温度为40℃,最适pH值为6．0。     

过量表达苹果酸酶对E.coli FMJ39厌氧混合酸发酵的影响

为了考察苹果酸酶对厌氧混合酸发酵影响,从E.coli DH5α中PCR扩增苹果酸酶（NAD+-dependent, E.C1.1.1.38）基因sfcA,插入质粒pTrc99a构建了表达质粒pTrc99a-sfcA,有氧和厌氧的条件下,IPTG诱导在E.coli FMJ39（ldh,pfl）中均获得大量表达,从而构建和加强了一条在厌氧混合酸发酵中微弱的代谢途径。厌氧发酵结果表明,过量表达苹果酸酶会影响混合酸发酵中甲酸、乙酸、丁二酸途径。重组FMJ39甲酸和乙酸的量分别比FMJ39提高了17.58%和15.27%,丁二酸的量降低了26.87%,柠檬酸的量变化不大。证实即使pfl基因缺陷,高浓度的L-Thr和L-Ser也会诱导Tdc 操纵元把丙酮酸转化为甲酸和乙酸。实验结果为进一步改造和利用FMJ39奠定了基础。     

克雷伯氏菌甘油脱氢酶dhaD的克隆表达、纯化及酶学性质研究

以克雷伯氏菌基因组DNA为模板,扩增得到编码甘油脱氢酶（GDH）的基因dhaD,将其克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a(+)上,在E.coliBL21（DE3）中诱导表达,利用表达载体pET-28a(+)上的6·His-Tag标记选用Ni柱亲和层析法纯化表达具有活性的甘油脱氢酶(GDH),纯化后比酶活达到156U/mg,纯化倍数达4.6倍,回收率为67.4%。并初步研究了该酶的酶学性质,酶反应的最适pH为11.0,在pH7.0～12.0范围内稳定;酶反应的最适温度为30℃,稳定范围为25～45℃; 酶动力学参数以甘油为底物的Km为0.54 mmol/L, Vmax为0.49 μmol/(mL·min)。     

Molecular characterization and expression of pyruvate formate-lyase-activating enzyme in a ruminal bacterium,Streptococcus bovis

To clarify the significance of the activation of pyruvate formate-lyase (PFL) by PFL-activating enzyme (PFL-AE) in Streptococcus bovis, the molecular properties and gene expression of PFL-AE were investigated. S. bovis PFL-AE was deduced to consist of 261 amino acids with a molecular mass of 29.9 kDa and appeared to be a monomer protein. Similar to Escherichia coli PFL-AE, S. bovis PFL-AE required Fe(2+) for activity. The gene encoding PFL-AE (act) was found to be polycistronic, and the PFL gene (pfl) was not included. However, the act mRNA level changed in parallel with the pfl mRNA level, responding to growth conditions, and the change was contrary to the change in the lactate dehydrogenase (LDH) mRNA level. PFL-AE synthesis appeared to change in parallel with PFL synthesis. Introduction of a recombinant plasmid containing S. bovis pfl and the pfl promoter into S. bovis did not affect formate and lactate production, which suggests that the activity of the pfl promoter is low. When the pfl promoter was replaced by the S. bovis ldh promoter, PFL was overexpressed, which caused an increase in the formate-to-lactate ratio. However, when PFL-AE was overexpressed, the formate-to-lactate ratio did not change, suggesting that PFL-AE was present at a level that was high enough to activate PFL. When both PFL-AE and PFL were overexpressed, the formate-to-lactate ratio further increased. It is conceivable that LDH activity is much higher than PFL activity, which may explain why the formate-to-lactate ratio is usually low.     

Expression of the pfl gene and resulting metabolite flux distribution in nuo and ackA-pta E. coli mutant strains

Our laboratory previously studied the interaction between nuo and the acetate-producing pathway encoded by ackA-pta in Escherichia coli. We examined metabolic patterns, particularly the ethanol and acetate production rates, of several mutant strains grown under anaerobic growth conditions. Since the pyruvate formate-lyase (PFL) pathway is the major route for acetyl-CoA and formate production under anaerobic conditions, we examined the effects of nuo and ackA/pta mutations on the expression of pyruvate formate-lyase (pfl) under anaerobic conditions. The ackA-pta mutant has a pfl::lacZ expression level much higher than that of the wild-type strain, and cultures also exhibit the highest ethanol production. Real-time PCR demonstrated that the adhE gene expression in the ack-pta mutant strain was approximately 100 fold that of the same gene in the ackA-pta nuo mutant strain. This result correlates with the observed ethanol production rates in cultures of the strain. However, the lack of exact correlation between the ethanol production rates and the RT-PCR data suggests additional regulation actions at the posttranslation level. In addition, the activity of the pfl gene as indicated by mRNA levels was also considerably greater in theack-pta mutant. We can conclude that deletions of nuo and ack/pta can partially affect the expression of the genes encoding adhE and pfl under anaerobic conditions.     

拟南芥VSP2蛋白的重组表达及其酸性磷酸酶活性的测定

通过PCR扩增从拟南芥cDNA文库中得到VSP2蛋白的编码序列,将其构建到原核表达载体pET-22b上,并在大肠杆菌BL21菌株中实现高效可溶表达。经过Ni-NTA亲和层析一步纯化,获得电泳纯的重组VSP2蛋白。以pNPP为底物检测,该蛋白具有酸性磷酸酶活性,反应的最适pH值4.5,最适温度为45oC,Km值为26.2mM。重组VSP2蛋白表达量高,纯化后均一性好,适于蛋白晶体生长。     

Gluconobacter oxydans木糖醇脱氢酶基因的克隆表达及木糖醇的转化分析

从氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)的基因组DNA上扩增出木糖醇脱氢酶基因xdh,构建了诱导型表达载体pSE-xdh,导入E.coli JM109后获得了高效表达木糖醇脱氢酶基因的重组菌JM109/pSE-xdh。通过HisTrap HP亲和层析和SephacrylS 300分子筛两步纯化从细胞中得到纯酶,并对酶学性质进行研究。XDH最适还原反应的pH值为5.0,最适还原反应的温度为35℃;最适氧化反应的pH值为11.0,最适氧化反应的温度为30℃。重组菌中的XDH依赖NADH,对NADH的米氏常数Km=57.8 mmol/L,最大反应速率Vmax=1209.1 mmol/(ml·min)。重组菌的XDH酶活力为13.9 U/mg。利用重组菌和原始菌混合静止细胞转化D 木酮糖,16 h 28.0 g/L D木酮糖生成16.7 g/L木糖醇,而原始菌单独转化只生成8.3 g/L木糖醇。     

硫酸乙酰肝素3-O硫酸基转移酶5的表达、纯化及酶学性质研究

经过PCR克隆得到硫酸乙酰肝素3-O硫酸基转移酶5(3-OST-5)的基因,将其与大肠杆菌表达载体pET-15b连接后,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,使用镍亲和层析柱纯化得到具有活性的3-OST-5。经测定纯化后的3-OST-5比活达到0.58 U/mg,是纯化前的5.27倍,回收率达80.4%。在此基础上,研究了该酶的酶学性质,酶反应的最适温度为35℃,稳定范围为20-40℃;最适pH为7.0,在pH7.0-9.0范围内稳定。在反应液中加入终浓度为1 mmol/L的K+、Ca2+、Ba2+对酶促反应有一定的促进作用。     

乙型肝炎病毒DNA聚合酶反式调节蛋白HBVDNAPTP1的表达、纯化与初步鉴定

目的构建HBVDNAPTP1基因的原核表达载体,诱导其在大肠埃希菌中表达,并对融合蛋白进行纯化。方法利用逆转录-PCR获得乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶(Polymerase)反式调节人类新基因HBVD-NAPTP1,测序正确后插入至原核表达载体pET-32a(+)中,转化BL21(DE3)宿主菌进行诱导,并利用组氨酸亲和层析方法对融合蛋白进行纯化。结果 HBVDNAPTP1原核表达载体转化宿主菌后,经0.5 mmol/L IPTG、30℃诱导5 h获得了分子量约为31 kD的HBVDNAPTP1融合蛋白的优化表达,Western blotting证实融合蛋白的特异性。亲和层析纯化后得到较纯的HBVDNAPTP1融合蛋白,每升培养菌液中可获得2.24 mg的纯化蛋白。结论成功获得纯化的HBVDNAPTP1融合蛋白,为今后开展HBVDNAPTP1的生物学功能研究奠定了物质基础。     

单纯疱疹病毒1型囊膜糖蛋白gD在大肠杆菌中的表达、纯化及其免疫活性的鉴定

目的:在大肠杆菌中表达1型单纯疱疹病毒(HSV-1)囊膜糖蛋白gD,纯化重组蛋白并对其免疫活性进行鉴定。方法:将HSV-1 gD 基因克隆入原核表达载体pET-28b,利用异丙基-B-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导重组质粒转化的大肠杆菌,探讨IPTG浓度、诱导时间、诱导温度对重组蛋白表达的影响;盐酸胍裂解变性包涵体,镍柱亲和层析法纯化gD蛋白,并对纯化后的蛋白进行透析复性;Western blot和ELISA检测gD蛋白的免疫活性。结果:酶切和测序结果表明gD基因克隆入pET-28b载体。该重组质粒转化的大肠杆菌经IPTG诱导后重组蛋白主要以包涵体形式存在,大小约40kDa。gD蛋白诱导表达的最佳条件为0.5mmol/L IPTG于37℃诱导8h。镍柱亲和层析法纯化获得的gD蛋白总量为3.1mg/L,透析复性后获得的gD蛋白总量为1.3mg/L,复性率为41.37%。Western blot及ELISA检测表明表达的gD蛋白具有免疫活性。结论:在大肠杆菌中表达并纯化获得具有免疫活性的HSV-1 gD蛋白,为进一步制备HSV-1诊断试剂和预防疫苗奠定了基础。