人β防御素3 融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化与活性分析

近年来由于抗生素的不规范使用等多种原因,细菌耐药问题日益严重,人们正努力从各个方面来解决,其中机体天然产生的肽抗生素(peptide antibiotics)由于其对耐药菌的强大抗菌作用而受到人们的关注。肽抗生素是一种阳离子小分子多肽,在天然免疫和获得性免疫中都发挥着重要作用。防御素(defensin)是肽抗生素中较为重要的一种,主要来源于皮肤、呼吸道等的上皮组织,是正常机体抵抗外界病原微生物入侵的重要防线。人β-防御素3(human beta-defensin 3,hβD-3)参与人体免疫屏障,并因具有广谱抗菌和抗菌活性不被盐离子浓度抑制等特点而具特别的研究开发价值：提取中国人扁桃体组织总RNA,以RT-PCR技术扩增编码hβD-3成熟肽的cDNA并构建于原核表达载体pQE-80L,IPTG诱导表达后利用SDS-PAGE、免疫印记等方法对重组蛋白进行分析。重组蛋白表达量达到细菌表达总量的40％。重组蛋白自表达菌包涵体中提取后,经亲和层析法纯化目的蛋白达到电泳纯,经多步透析法复性,在体外抗菌实验中表现出了对金黄色葡萄球菌、多重耐药金黄色葡萄球菌等的抗菌活性,为进一步的研究和开发奠定了基础。     

人β神经生长因子在大肠杆菌中的高表达

将编码人β神经生长因子(Huβ-HGF)的基因克隆到由T7噬菌体启动子控制的pET11c大肠杆菌表达载体中,重组质粒经鉴定含有Huβ-NGF基因,未解聚的表达产物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),结果显示出二聚体27kD的蛋白带。而完全解聚的表达产物SDS-PAGE显示出一条13β5kD单体带。经凝胶电泳扫描,表达带占菌体总蛋白的14.5％。用兔抗鼠β—NGF的多克隆抗体进行的Western-Blot的结果表明,二聚体同单体都有免疫原性。在生物活性的鉴定中,菌体表达产物可以使小鸡鸡胚的背根神经节产生神经元突起,由此可以证明该表达产物有较高的生物活性。     

重组人β防御素3在大肠杆菌中的表达和活性分析

防御素是生物界广泛分布的一类低分子短肽,具有广谱高效的杀菌、抗肿瘤作用,并且不易使微生物产生抗药性,具有很高的应用价值,其中最引人注目的是β防御素[1,2].人β防御素3(humanβ-defensin3,hBD3)是最近发现的第3种人源性β防御素,与其它人防御素相比,在抗菌活性等方面具有明显优势,是所有防御素中抗菌能力最强的之一[3~7],具有独特的研究和开发价值.为了得到高效表达hBD3的工程菌株,本实验按照细菌对密码子的偏爱,人工合成了hBD3的寡核苷酸片段,构建了其表达载体.经IPTG诱导、分离纯化和肠激酶切割,得到了与天然hBD3活性基本相同的…     

鸡β-防御素7在大肠杆菌中的表达及活性分析

【目的】根据鸡β-防御素7(Gal-7)的成熟肽基因序列合成基因,构建表达Gal-7的大肠杆菌工程菌,研究重组鸡防御素Gal-7成熟肽的体外生物活性。【方法】将合成的gal-7基因克隆到大肠杆菌表达载体pGEX-6p-1中,得到重组质粒pGEX-6p-gal7,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达得到含GST标签的融合蛋白GST-Gal7;之后用Prescission蛋白酶将GST标签切除,并对成熟肽进行质谱分析;再利用琼脂打孔扩散法检测Gal-7成熟肽的体外抑菌活性,用2倍稀释法测定对指示菌的最低抑菌浓度。【结果】成功构建Gal-7大肠杆菌异源表达工程菌,表达纯化的重组Gal-7成熟肽质谱鉴定分子量为5 516 Da,其对黄色微球菌(NCIB 8166)、金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、粪肠球菌(ATCC 29212)、大肠杆菌(CMCC 44102)均有抑菌活性,最低抑菌浓度分别为16.875、67.5、67.5、135 mg/L。【结论】获得表达鸡Gal-7成熟肽的大肠杆菌工程菌,并且切除GST标签的Gal-7成熟肽具有生物活性。     

人β防御素3在大肠杆菌中可溶性表达及其生物活性的鉴定

根据大肠杆菌对精氨酸密码子使用的偏好,设计引物并通过酶促法合成了人β防御素3(hBD-3)全基因序列,克隆进pGEX-4T-2中构建pGEX-4T-2-hBD-3融合表达载体．将表达载体转化Ecoli宿主菌DH5α,进行IPTG诱导表达．控制诱导条件,提高可溶性蛋白的表达量．将菌体进行反复冻溶使细胞膜穿孔,释放可溶性蛋白．融合蛋白GST-hBD-3经凝血酶切割得到重组人防御素蛋白．用琼脂孔穴扩散抑菌法检测表明,重组人β防御素3对金黄色葡萄球菌有抑菌活性．     

IL-1β的基因克隆及在原核中的表达

从人外周血中分离出白细胞,提取其总RNA,根据文献报道的IL1β的核苷酸序列合成5′和3′端引物,用RTPCR的方法获得了IL1β的基因cDNA,并在大肠杆菌中获得了高效表达,表达量占全菌的40%,并对表达产物进行了分离纯化和活性分析,获得了纯度大于98%的样品,该样品表现出明显的生物学活性。     

大肠杆菌表达GST-Aβ42融合蛋白的纯化条件及鉴定

目的：为了提高β-淀粉样蛋白（β-amyloid peptide,Aβ42基因在大肠杆菌中的表达,为深入研究Aβ的作用机制及其疫苗研究奠定基础。方法：大肠杆菌在37℃培养4 h后,以终浓度为1 mmol/L的IPTG在25℃下继续诱导培养2 h,促进GST-Aβ42融合蛋白的可溶性表达。表达产物以SDS-PAGE、Western bloting鉴定。结果：SDS-PAGE表明融合蛋白分子量约为32kD,与预计的一致;Western Blotting进一步分析表明它能与抗Aβ42和抗GST抗体特异反应。结论：GST-Aβ42基因的优化表达为研究Aβ42的作用机理打下了基础,同时也为Aβ42疫苗的研究提供了充分的实验条件。     

大肠杆菌中融合表达人β防御素-3基因的研究

目的 为了在大肠杆菌中融合表达人β防御素-3基因。方法 根据大肠杆菌对精氨酸密码子使用的偏爱性,设计搭桥引物,并通过PCR扩增法合成了人β防御素的全基因序列,克隆进pGEX-4T-2中构建pGEX-4T-2-hBD-3融合表达载体。将表达载体转化E.coli宿主菌DH5α,进行IPTG诱导表达。将菌体反复冻溶使细胞膜穿孔,释放可溶性蛋白。融合蛋白GST-hBD-3经凝血酶切割。结果 研究得到了重组人防御素蛋白,琼脂孔穴扩散抑菌法检测表明,重组人β防御素3对金黄色葡萄球菌有抗菌活性,抑菌效价为0.843 U。结论 人β防御素-3基因在大肠杆菌中得到了融合表达。     

乳糖作为诱导剂对人β-防御素3蛋白表达的影响

对人β-防御素3基因工程菌株BL21-pET-hBD3的乳糖诱导条件进行了研究。乳糖浓度、诱导时间和诱导温度对菌株生长和目的蛋白表达的试验结果显示,高浓度乳糖对菌株生长有抑制作用（P〈0．01）,对目的蛋白的表达无显著影响（P〉0.05）,延长诱导时间对菌株生长有利（P〈0．01）,但对蛋白的表达无显著影响（P〉0.05）。以0．5％乳糖在37℃诱导4h对目的蛋白的表达有利,目的蛋白的含量可达28,1％。控制好诱导条件,乳糖与IPTC的诱导效果基本相当。     

人β防御素3和植物des-pGLu1-brazzein融合蛋白表达菌的诱导条件优化及其活性分析

对人β防御素3和植物甜蛋白des-pGlu1-Brazzein嵌合基因的工程菌株BL-pET-hBD3-Bra的IPTG诱导表达条件进行了研究,同时对所表达的目的蛋白进行了纯化和活性分析.IPTG浓度、诱导时间和诱导温度对菌株生长和目的蛋白表达的试验结果显示:所取的IPTG浓度(0.2～1.0 mmol/L)对菌株生长和目的蛋白的表达无显著影响(P>0.05);菌株的生物量随着诱导时间的延长而增加,6 h优于4 h(P<0.01),但是蛋白的表达量无明显增加(P>0.05);其中温度是重要的影响因素,在30℃诱导时,目的蛋白的表达量占总蛋白的35%左右.进一步的研究表明,菌株在30℃-32℃生长,在30℃诱导最优.对目的蛋白的活性分析表明,所得到的hBD3-Bra融合蛋白有甜味,其甜度大约是蔗糖的200倍,但是其杀菌活性很弱,经凝血酶切割后,des-pGlu1-Brazzein的甜度大大提高,大约为蔗糖甜度的600倍,重组hBD3对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有明显的抑菌活性.     

乳糖作为诱导剂对人β-防御素3蛋白表达的影响*

对人β-防御素3基因工程菌株BL21-pET-hBD3的乳糖诱导条件进行了研究。乳糖浓度、诱导时间和诱导温度对菌株生长和目的蛋白表达的试验结果显示,高浓度乳糖对菌株生长有抑制作用(P<0.01),对目的蛋白的表达无显著影响(P>0.05),延长诱导时间对菌株生长有利(P<0.01),但对蛋白的表达无显著影响(P>0.05)。以0.5%乳糖在37℃诱导4h对目的蛋白的表达有利,目的蛋白的含量可达28.1%。控制好诱导条件,乳糖与IPTG的     

甘油脱水酶β亚基融合蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化

为了表达及纯化甘油脱水酶β亚基蛋白,采用PCR及DNA重组技术将甘油脱水酶β亚基基因gldB重组到含麦芽糖结合蛋白(MBP)的融合蛋白表达载体pMAL-c2x中,在大肠杆菌中进行表达。结果表明,转化重组质粒pMAL/gldB的大肠杆菌经IPTG诱导,SDS-PAGE分析显示：表达出的MBP-glddB融合蛋白相对分子质量约72000,与预期大小一致,并经Western blot分析证实。进一步通过直链淀粉树脂亲和层析纯化得到电泳均一的融合蛋白。已获得的重组甘油脱水酶β亚基蛋白有利于研究其生物学性能。     

人GST-14-3-3σ融合蛋白的原核表达、纯化及活性检测

目的:构建人14-3-3σ基因的原核表达载体,获得其原核表达产物,并对融合蛋白进行纯化及活性检测。方法:采用PCR技术从人乳腺文库中扩增14-3-3σ基因编码序列,将其克隆到pGEX-KG载体中,重组质粒转化大肠杆菌Rossate后表达重组蛋白,利用GST-Sepharose 4B亲和珠对原核表达产物进行纯化,并通过SDS-PAGE和Western印迹检测融合蛋白的表达,采用GST pull-down技术检测已纯化的蛋白与已知体外相互作用蛋白AKT之间的相互作用。结果:从人乳腺文库中扩增获得约750 bp的DNA片段,并成功克隆至pGEX-KG载体上,经双酶切鉴定得到与预期片段大小相符的外源基因插入片段,测序与目的基因序列完全一致;在Rossate菌株中诱导表达出相对分子质量约52 000的目的蛋白,SDS-PAGE和Western印迹结果表明融合蛋白表达成功,并纯化得到GST-14-3-3σ融合蛋白;通过GST pull-down技术检测证实GST-14-3-3σ融合蛋白可以和AKT在体外结合,并证实其具有生物学活性。结论:获得了原核表达的活性较好的GST-14-3-3σ蛋白,为后续研究细胞周期蛋白调控机制奠定了实验基础。     

Trx-NAP 5融合蛋白在大肠杆菌中的表达及其活性检测

目的:用大肠杆菌表达获得重组线虫抗凝血肽5(rNAP 5),为研究开发NAP5的功能与应用提供原料来源。方法:将扩增的NAP5基因经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后与表达载体pET-32a连接。构建好的重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)后,分别经IPTG和乳糖诱导表达,并探讨诱导表达条件,分析表达产物的可溶性情况。表达产物经镍亲和纯化后,用凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(aPTT)检测体外抗凝活性。结果:成功构建了pET-32a/NAP5表达载体,IPTG和乳糖均能诱导目的蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中高效地可溶性表达。优化条件下每升LB培养基可获可溶性目的融合蛋白量达65.3mg。纯化的蛋白能明显延长PT及aPTT,7.0mg/L的蛋白平均约延长5.09倍aPTT,2.55倍PT。结论:在大肠杆菌中成功表达了具有很好生物活性的Trx-NAP5融合蛋白,为研究开发NAP5的功能与应用奠定了基础。     

人膜联蛋白V在大肠杆菌中的表达、纯化与鉴定

目的：构建人膜联蛋白V的原核栽体并诱导其表达。方法：以IPTG诱导His融合人膜联蛋白V的表达,并应用Ni—NTA Superflow纯化。结果：PCR扩增产物碱基数量与目的片段大小一致,插入片段的序列与发表的人膜联蛋白V基因编码序列一致。在IPTG诱导下,重组大肠杆茵DH5a高效表达分子量约36kDa的目的产物。结论：人膜联蛋白V编码序列已被克隆至His融合表达载体pET-28a（＋）上,并在大肠杆菌DH5α中表达：     

Ataxin-3融合蛋白表达、纯化及抗血清的制备

目的:表达GST-ataxin-3-N融合蛋白并制备GST-ataxin-3特异性抗体,为深入研究其功能及其在SCA3发病机制中的作用提供重要的技术和材料保障.方法:将人ataxin-3氨基端基因克隆入原核表达载体pGEX-4T-2,在大肠杆菌(E.coli)BL21中表达,用Glutathione sepharose4B凝胶亲和柱纯化目的蛋白.利用纯化的GST-ataxin-3-N蛋白制备多克隆抗体.结果:成功构建了原核表达载体,得到高表达量的融合蛋白,经亲和层析柱纯化获得较高纯度的GST-ataxin-3-N融合蛋白.以融合蛋白免疫新西兰兔得到Ataxin-3-N多克隆抗体,Western Blotting及免疫荧光均证实该抗体能够识别Ataxin-3-myc蛋白,具有较高特异性.结论:利用原核表达人GST-ataxin-3-N融合蛋白制备的Ataxin-3多克隆抗体具有较好的特异性,可用于该蛋白的相关研究.     

PTD-hEGF融合蛋白在大肠杆菌中的表达及活性分析

为获得hEGF在大肠杆菌中的高效表达,构建了pPTD-hEGF原核表达载体。将其转化大肠杆菌BL21(DE3),经0.3mmol/LIPTG诱导,PTD-hEGF融合蛋白进行了有效表达,表达产物主要形成了包涵体。经Ni2 -NTA亲和层析纯化,融合蛋白的纯度达99.5%。MALDI-TOF-MS分析证明表达的融合蛋白氨基酸序列完全正确。PTD-hEGF融合蛋白能明显促进HEK-293细胞的分裂和生长。     

人防御素HNP-1基因在原核系统中的克隆与表达

通过化学合成法制备人防御素 HNP- 1基因 ,并将其构建于带有 GST基因的表达载体中 ,进行融合表达 ,表达融合蛋白可占菌体蛋白的 70 %左右 ,且主要以包含体形式存在。改变培养条件可适当提高可溶性融合蛋白的比例。融合蛋白通过凝胶色谱进行纯化 ,然后经凝血酶切释放出防御素多肽 ,并通过抑菌试验对其活性进行检测。结果显示 ,可能由于分子间的二硫键错配造成了防御素分子构象改变 ,使制备的防御素分子未显示出活性     

人膜联蛋白Ⅴ在大肠杆菌中的表达、纯化与鉴定

目的:构建人膜联蛋白Ⅴ的原核载体并诱导其表达.方法:以IPTG诱导His融合人膜联蛋白Ⅴ的表达,并应用Ni-NTASuperflow纯化.结果:PCR扩增产物碱基数量与目的片段大小一致,插入片段的序列与发表的人膜联蛋白Ⅴ基因编码序列一致.在IPTG诱导下,重组大肠杆菌DH5α高效表达分子量约36 kDa的目的产物.结论:人膜联蛋白Ⅴ编码序列已被克隆至His融合表达载体pET-28a( )上,并在大肠杆菌DH5α中表达.