斑马鱼消化器官发育缺陷突变体的遗传筛选

目的正向遗传筛选斑马鱼肝脏、肠和胆囊发育缺陷突变体。方法 ENU诱变野生型斑马鱼并开展经典的F2代筛选,以lfabp为探针的全胚原位杂交、BES-H2O2-Ac荧光染料分别检测斑马鱼早期胚胎肝脏、肠和胆囊的表型。结果在128个突变基因组中筛选获得了源自14个F2家族的斑马鱼消化器官发育缺陷突变体品系23个,并按表型划分为6类。结论斑马鱼肝脏、肠和胆囊的发育调控机制有相似性和差异性。     

斑马鱼gpr98基因敲除试验模型的构建

gpr98基因突变与多种疾病相关,该基因在人类和斑马鱼中高度保守。建立斑马鱼gpr98基因突变体稳定系,可为阐释gpr98基因功能提供良好的动物模型和研究基础。本文利用CRISPR/Cas9基因敲除技术在斑马鱼gpr98基因2号外显子上选取两个相距42bp的靶位点,分别体外合成sgRNA,并与Cas9 mRNA一起共注射至斑马鱼胚胎单细胞期的胚胎内。随机挑选发育72h胚胎提取基因组DNA进行PCR分析,结果表明:除了有野生型DNA带外,部分胚胎有一条比野生型DNA小的带;进一步将F0代阳性个体与野生型的斑马鱼杂交,对杂交后代进行基因型分析,并成功筛选到缺失48bp(Δ48bp)的稳定遗传突变的gpr98基因敲除斑马鱼模型。该试验模型的构建为研究gpr98基因在心血管以及骨骼等组织器官的发育及相关疾病发生中的作用奠定了重要基础。     

水稻温度超敏突变体ths1的鉴定和基因定位

从籼稻品种‘Kasalath’甲基磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate,EMS)诱变突变体库中筛选到一个温度敏感突变体ths1(temperature hyper-sensitive 1)。与野生型相比,突变体ths1的主根伸长和侧根发育对温度变化非常敏感:在30°C条件下ths1表型与野生型一致;在温度低于26°C时,ths1主根变短,侧根缺失。在低温(24°C)条件下ths1侧根原基停留在原基起始阶段,根尖ROS含量显著高于野生型。遗传分析显示,ths1表型由半显性单基因控制。利用F2群体对ths1基因进行定位,将突变基因定位在第1染色体长臂着丝粒附近C01M14到RM11110两个标记之间的694 kb区间。研究结果为进一步克隆THS1基因,揭示植物感受外界温度变化的分子生理机制奠定基础。     

成年斑马鱼OKR行为学分析

作为视功能检测和与视觉有关突变体筛选的方法, 眼动(Optokinetic response, OKR)和视动(Optomoter response, OMR)行为学是简单有效的视功能检测手段, 广泛用于幼年斑马鱼研究中, 而成年斑马鱼OKR的分析方法却很少有报道。文章介绍了成年斑马鱼眼动反应诱导方式, 以及使用模板匹配(Pattern match)的方法程序跟踪眼部运动, 实现了成年斑马鱼OKR的定量分析。使用该方法, 检测到斑马鱼双眼视觉区对OKR行为的产生具有一定的贡献作用, 并且成年斑马鱼单眼对运动光栅表现出一定的方向敏感性。同样的方法也可适用于幼年斑马鱼的OKR行为学分析。利用此方法初步检测到了钟基因period1b突变体幼鱼的OKR异常。     

可示踪转基因斑马鱼胰岛β细胞破坏和再生模型分析

本研究目的是在斑马鱼体内建立符合高通量药物筛选条件的胰岛β细胞破坏模型,用于筛选出针对糖尿病胰岛β细胞再生的药物。利用胰岛素-硝基还原酶-绿色荧光蛋白(insulin-nfs B-green fluorescent protein;INS-nfs B-GFP)转基因系F1/F2代胚胎分为A组(正常对照组),根据胚胎时相大小分为3个大组,B组受精后24 h(24 hours postfertilization,24 hpf)、C组受精后36 h(36 hours postfertilization,36 hpf)、D组受精后48 h(48 hours postfertilization,48 hpf),分别在不同毫摩尔(mmol/L)浓度(5 mmol/L,7.5 mmol/L,10 mmol/L,15 mmol/L)的甲硝唑中孵育24~48 h,通过体式倒置荧光显微镜和共焦显微镜观察斑马鱼胰岛β细胞破坏及荧光表达的情况,同时用原位杂交方法进一步在分子水平证实。结果显示,斑马鱼胚胎36 hpf加10 mmol/L浓度的甲硝唑并孵育36 h,荧光明显消失,并且畸形率和死亡率较低,是创造胰岛条件β细胞破坏的转基因斑马鱼模型的理想条件,在此基础上去甲硝唑10~86 h后继续观察胰岛β细胞再生,结果发现在去除甲硝唑24 h(即斑马鱼胚胎96 hpf)时胰岛β细胞开始再生。本模型的建立对于糖尿病的临床价值和应用前景有着非常重要的意义,利用这一条件使高通量筛选具有胰岛功能恢复作用药物成为可能,将为糖尿病的治疗开辟新的道路。     

Fus在斑马鱼生长发育及两性生长异形中的功能

为研究肉瘤融合基因(fus)在鱼类中的功能, 在斑马鱼中利用CRISPR/Cas9基因突变技术使fus基因产生移码突变。fus-/-纯合突变体斑马鱼发育正常并且完全可育, 但体长和体重在幼鱼和成年阶段都小于野生型斑马鱼。此外, 相较于野生型斑马鱼, fus-/-纯合突变体斑马鱼不存在雌鱼身体比例大于雄鱼的性别异形现象。在fus-/-纯合突变体斑马鱼早期幼鱼发育阶段, 一些生长相关基因包括gh1、ghra、igf1、igf2a、stat5.1和socs6的表达水平显著低于野生型斑马鱼但其运动能力并未受到影响。因此, 不同于fus基因在哺乳动物中的功能, 它在斑马鱼中不参与运动神经元的发育, 但在调节鱼类躯体生长发育与两性生长异形方面有着重要的功能。     

抗赤霉病小麦地方品种黄方柱和海盐种EMS突变体的变异分析

突变体对增加小麦资源的遗传多样性,克隆和解析重要农艺、产量和抗性相关基因具有重要的意义。本研究以高抗赤霉病小麦品种黄方柱(HFZ)及其11个甲磺酸乙酯(EMS)诱导的纯合突变体(F2~F12,Mu4),以及海盐种(HYZ)及其12个EMS纯合突变体(Y2~Y13,Mu4)为材料,在扬花期利用单花滴注鉴定赤霉病扩展抗性,灌浆期测定了分蘖数、株高、旗叶长、旗叶宽、叶绿素含量,收获后测定千粒重、粒长、粒宽、每穗小穗数和每穗粒数共计11个性状。每一个突变体至少在一个性状上与野生型存在显著差异。黄方柱突变系F6、F9和F12以及海盐种突变系Y6、Y7和Y9病小穗率均显著高于相应野生型,达中感或高感水平,因此,这6个突变体是研究赤霉病扩展抗性的理想材料。此外,海盐种突变体株高、千粒重、每穗粒数和粒宽均低于或显著低于野生型。对野生型和突变体采用了基于最小组内平方和距离的动态聚类分析方法,综合评价了野生型与突变体以及突变体相互之间的相似情况。株高等农艺性状显著优于野生型但赤霉病抗性与野生型类似的突变体(如F2、F7、Y2、Y3、Y4、Y8、Y10和Y12)可为农艺性状的遗传研究和抗赤育种亲本选配提供重要的资源。     

罗布麻EMS突变体库构建及黄酮变异突变体筛选

罗布麻(Apocynum venetum L.)突变体的获得是人工创新种质资源的有效途径,也是开展品种选育、功能基因组研究的基础。本研究以采自东营野生罗布麻种子作为材料,预试验结果表明0.7%的甲基磺酸乙酯(EMS,ethylmethylsulfone)溶液诱变罗布麻种子13 h能够达到半致死剂量。在此浓度和处理时间下构建了一个1452株的突变体群体,对获得的M1植株进行农艺性状和总黄酮含量性状筛选,初步获得125份农艺性状突变材料,其中包括8株白化植株、23株叶型变异株、16株叶色黄纹突变体、32株苗期分枝植株以及46株叶位变异突变体,突变频率分别为0.55%、1.6%、1.1%、2.2%和3.2%。此外,还筛选到2株总黄酮含量明显高于野生型和1株低于野生型的材料。在突变群体中对黄酮代谢途径中编码黄烷酮-3-羟化酶的基因(F3H,flavanone 3-hydroxylase gene)进行测序鉴定,结果鉴定到3株F3H基因的突变体。本研究构建的罗布麻突变体库表型丰富且突变位点可以鉴定,是罗布麻新种质筛选、品种选育以及基因功能研究的良好材料。     

酸性环境下铝对斑马鱼运动行为和学习记忆能力的影响暨与阿尔海默茨症的相互关系

运用行为学方法通过金属离子诱发神经毒性,建立阿尔海默茨症动物模型。通过运动行为观察、应激回避条件模型检测在pH值为7.8、6.8、5.8条件下暴露铝离子24h和96h后铝离子对成年斑马鱼运动行为和学习记忆能力的作用,探讨金属元素在酸性环境下诱发神经毒性导致阿尔海默茨症与运动行为、学习记忆的关系。结果表明,pH5.8铝离子组暴露96h的运动行为活性和学习记忆能力与pH7.8铝离子组和pH6.8铝离子组相比有较显著变化。同时,pH5.8铝离子组暴露96h运动行为活性和学习记忆能力与pH5.8铝离子组暴露24h相比出现明显降低。这些都表明,铝在酸性环境下,与pH相互作用影响斑马鱼的运动行为与学习记忆能力,可能造成斑马鱼大脑关于记忆功能区域出现损伤,诱发神经毒性产生类似阿尔海默茨症发病症状。     

SB转座子介导的斑马鱼增强子捕获注解分析

为了建立斑马鱼增强子捕获突变体库及研究功能基因的表达调控模式,制备了SB转座子介导的增强子捕获转基因斑马鱼(F0),通过繁育建立了组织或器官特异表达报告基因绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)的品系(F1)。选择F1代的SK-3系(脑部特异表达GFP)与野生型TU系斑马鱼交配,收集受精卵(F2),于24 hpf(Hour post fertilization)、2 dpf(Day post fertilization)、3 dpf、4 dpf、5 dpf、7 dpf 6个发育阶段检测报告基因绿色荧光蛋白的表达模式;然后通过Splinkerette PCR(SP-PCR)方法检测SB转座子在斑马鱼基因组中的插入位置,从而确定捕获的增强子和功能基因;最后通过胚胎原位杂交验证内源基因表达模式。结果表明,在F2代胚胎不同发育阶段,GFP表达具有明显的时空特性,前期在前脑,中脑,后脑三个部位均高水平表达,后期表达部位呈后移趋势,各个发育期表达强度基本无变化,结果提示该捕获增强子具有脑部表达特性。sp-PCR结果分析表明增强子位于基因组1号染色体35、914、498-35、914、621位置,在内源性基因ednraa位点附近。原位杂交结果表明该基因在胚胎24 hpf阶段具有转录活性。本研究结果提示SB转座子介导的增强子捕获技术可高效获得插入突变斑马鱼,对研究基因功能和获得具有自主知识产权的新基因具有重要作用。