腺嘌呤对大肠杆菌DH5α和其耐乙酸突变株DA19 代谢流分布的影响

【目的】本文通过分析在基本培养基中添加腺嘌呤对大肠杆菌DH5α和其耐乙酸突变株DA19代谢流分布的影响,从而进一步了解二者在代谢调控方面的差异。【方法】对2个菌株分别在氮源限制基本培养基及添加腺嘌呤的氮源限制基本培养基中进行连续培养,分析两者代谢流变化差异,并与酶活测定结果进行比较。【结果】添加腺嘌呤降低了DH5α的葡萄糖比消耗速率和乙酸的比生成速率,提高了菌体关于葡萄糖的得率,而丙酮酸比生成速率变化不明显。与MN培养基相比,添加腺嘌呤后DH5α降低了乙酸分流比,提高了分泌丙酮酸和三羧酸循环分流比,同时明显改变了磷酸果糖激酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶和乙酸激酶酶活。与DH5α不同,添加腺嘌呤使得DA19的丙酮酸比生成速率增加了近57%,而其它参数无明显改变。与MN培养基相比,DA19在添加腺嘌呤后降低了三羧酸循环分流比,大大提高了分泌丙酮酸分流比,而关键酶活未发生明显改变。酶活变化与代谢流结果基本一致。【结论】由于大肠杆菌DH5α和DA19嘌呤核苷酸从头合成途径能力存在差异,因此添加腺嘌呤对两个菌株的代谢流分布产生了完全不同的影响。     

腺嘌呤对大肠杆菌DH5α及其耐乙酸突变株DA19生长和代谢的影响

大肠杆菌DH5α和DA19在碳源限制的基本培养基中进行分批培养和氮源限制的基本培养基中进行连续培养,发现添加腺嘌呤会使DH5α生长改善,乙酸产生减少;对DA19的生长和代谢影响不明显。连续培养细胞的蛋白质组分析结果显示:添加腺嘌呤后DA19 purH表达水平降低,而DH5α purH表达水平不变,表明DH5α嘌呤核苷酸从头合成能力差;DH5α yddS表达上调,gnd表达水平稍有提高,细胞生长改善。     

大肠杆菌DH5α及其耐乙酸突变株DA19在氮源限制下的代谢和关键酶特性研究

在氮源限制的基本培养基中对大肠杆菌DH5α及其耐乙酸突变株DA19进行连续培养,通过测定中心代谢途径关键酶的活性分析二者代谢差异。结果表明,DA19的6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)和异柠檬酸脱氢酶(ICDH)活性高于DH5α,而磷酸果糖激酶(PFK)和乙酸激酶(ACK)活性低于DH5α,反映了DA19进入磷酸戊糖途径(PPP)的碳流增加,而进入酵解和乙酸产生(Ack-Pta)途径的碳流减少。因此,关键酶活差异与DA19菌体关于葡萄糖得率提高、副产物乙酸和丙酮酸的生成减少相一致。添加腺嘌呤后,DH5α的G6PDH和ICDH活性增加,PFK和ACK活性降低,而DA19各酶活变化不明显。乙酸钠的添加导致除PFK外的其他酶活性均降低,尤其是DH5α的ICDH明显降低,这些结果反映的中心代谢途径流量变化也与二者生长和代谢副产物积累的变化一致。     

大肠杆菌DH5α耐乙酸突变株的选育及其代谢特性研究

大肠杆菌DH5α是基因工程常用的宿主菌之一,但由于对代谢副产物乙酸十分敏感,影响外源基因的表达效率。为了提高E. coli DH5α乙酸耐受力,采用60Co诱变结合连续培养,逐步提高稀释率和乙酸钠选择压力,于含乙酸钠平板进一步筛选,得到5株对乙酸耐受能力显著增强的突变菌株,具有良好的遗传稳定性,其中DA19显示最强的耐受性能。DA19与DH5α相比,在复合培养基YPS和YPS2G中菌体浓度分别提高17％和5％,最大比生长速率分别提高8％和27％,产乙酸分别减少为6％和59％;在基本培养基中的细胞浓度提高24倍,在含10g/L乙酸钠培养基中达到的细胞浓度与不加乙酸钠DH5α的细胞浓度相当。     

大肠杆菌乙酸代谢突变株的选育和特性研究

在大肠杆菌高密度培养中 ,因代谢副产物乙酸积累 ,导致抑制菌体的生长和产物表达的下降。为减小乙酸的抑制作用 ,采用60 Co诱变处理大肠杆菌JM1 0 1 ,结合连续培养 (含乙酸钠选择压力 )定向富集方法 ,选育到一株乙酸耐受性增强的菌株JL3。该菌株表现出明显的乙酸耐受性的提高 ,在含有 1 0 g/L乙酸钠的MA培养基中 ,菌体生长和葡萄糖消耗速率都有较大程度提高 ,并且具有良好的遗传稳定性     

不同浓度外源乙酸钠对耐乙酸大肠埃希菌DA19代谢和关键酶酶活的影响

为研究外源乙酸钠对大肠埃希菌DA19生长代谢的影响,将该菌株在氮源限制基本培养基及添加不同浓度乙酸钠的氮源限制基本培养基中连续培养,测定稳态时生长代谢参数和胞内关键酶酶活。与MN培养基相比,葡萄糖比消耗速率和延胡索酸比生成速率随外源乙酸钠质量浓度增加而逐渐下降,丙酮酸比生成速率则随外源乙酸钠质量浓度增加而明显增加,而乙酸比生成速率则明显降低(除9 g/L乙酸钠外)。磷酸果糖激酶、异柠檬酸脱氢酶、异柠檬酸裂解酶、苹果酸脱氢酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和乙酸激酶酶活随外源乙酸钠质量浓度增加而呈先下降后上升的趋势,而6-磷酸葡萄糖脱氢酶则随着外源乙酸钠质量浓度增加而逐渐降低。为了应对外源乙酸钠压力,大肠埃希菌DA19的生长代谢和中心代谢途径酶活都发生了明显改变。     

基因atpA、purHD和ndh的过量表达对大肠杆菌DH5α生长的影响

[目的]理解大肠杆菌DH5α及其耐乙酸突变株DA19在基本培养基中生长和乙酸积累差异的机理.[方法]根据前期针对两个菌株蛋白质组和培养中物料及能量平衡的分析,通过PCR分别扩增大肠杆菌DH5α及DA19的atpIBEFHAGDC基因、purHD基因和与NADH氧化代谢相关ndh基因及其各自的调节区,以及NADH脱氢酶Ⅰ基因(nuoA-N)的调节区.将atpA、purHD和ndh基因分别克隆到载体pTrc99a中,转化DH5α,研究基因过量表达对生长的影响.[结果]测序结果表明两个菌株的这些DNA序列与公布的大肠杆菌K-12的相应序列完全一致,在DH5α菌株中分别过量表达atpA、purHD或ndh基因可以在一定程度上改善菌体的生长.[结论]过量表达purHD或ndh基因比过量表达atpA基因的效果更好,但与DA19的生长相比仍然存在较大差距,反映了代谢全局调节的重要性.     

基于比速率及代谢流的黑曲霉突变株和野生株分析

黑曲霉具备优异的外源蛋白表达和分泌能力,从而被广泛应用于工业酶制剂的生产。通过研究黑曲霉突变株和野生株在相同培养条件下生理参数和代谢流的差异,确定了黑曲霉合成糖化酶过程中的限制性因素。宏观动力学分析发现,较之野生株,突变株具有较高的最大比生长速率,并且副产物得率降低了90%,底物利用率提高了近30%,表明突变株与野生株在碳源分配和产物转化率上具有明显的差异。利用流平衡分析（FBA）计算胞内代谢通量分布,发现还原力和核糖的供应水平是限制菌体合成的主要因素,而前体氨基酸是合成糖化酶最主要的限制性因素。这些研究结果为后续发酵工艺优化和菌株基因改造提供了有益的思路。     

微量元素对大肠杆菌生长和乙酸生成的影响研究

大肠杆菌DA19的代谢特性与培养基中添加微量元素有较大的关系。在基本培养基中,当氮源限制时,添加微量元素可以在一定程度上改善DA19菌体的生长,提高菌体得率YX/G,大大减少乙酸的生成;当氮源充分时,与不添加微量元素相比,DA19在添加微量元素后,菌体浓度大大增加,虽然葡萄糖消耗速率加快,但产乙酸仍然很少,只有不添加时的13％,YX/G提高至少60％。基本培养基中添加0.1～1mL/L的微量元素混合溶液对DA19菌体生长、乙酸生成及葡萄糖消耗没有显著影响。在单独添加不同种类的微量元素时, BO33-、Zn2+、MoO42+、Cu2+没有特别明显的影响,Al3+会抑制菌体生长和葡萄糖利用,而Co2+、Mn2+、Fe2+可以改善细胞生长,特别是添加Fe2+时,细胞生长及乙酸生成等培养结果与添加微量元素混合溶液几乎相同。     

基因atpA、purHD和ndh的过量表达对大肠杆菌DH5a生长的影响

【目的】理解大肠杆菌DH5a及其耐乙酸突变株DA19在基本培养基中生长和乙酸积累差异的机理。【方法】根据前期针对两个菌株蛋白质组和培养中物料及能量平衡的分析,通过PCR分别扩增大肠杆菌DH5a及DA19的atpIBEFHAGDC基因、purHD基因和与NADH氧化代谢相关ndh基因及其各自的调节区,以及NADH脱氢酶Ⅰ基因（nuoA-N）的调节区。将atpA、purHD和ndh基因分别克隆到载体pTrc99a中,转化DH5a,研究基因过量表达对生长的影响。【结果】测序结果表明两个菌株的这些DNA序列与公布的大肠杆菌K-12的相应序列完全一致,在DH5a菌株中分别过量表达atpA、purHD或ndh基因可以在一定程度上改善菌体的生长。【结论】过量表达purHD或ndh基因比过量表达atpA基因的效果更好,但与DA19的生长相比仍然存在较大差距,反映了代谢全局调节的重要性。     

柠檬酸钠对L-组氨酸发酵代谢流分布的影响

目的：建立谷氨酸棒杆菌TL1105生物合成L-组氨酸的代谢网络模型,并进行代谢网络计量分析。方法：通过所构建的L-组氨酸代谢网络模型,利用MATLAB软件计算出添加柠檬酸钠和不添加柠檬酸钠发酵中后期代谢网络的代谢流分布。结果：在L-组氨酸分批发酵过程中,在发酵初期未添加柠檬酸钠的条件下流向戊糖磷酸途径（HMP）的代谢流为9.59,合成组氨酸的代谢流为8.91;在发酵初期添加2g/L柠檬酸钠的条件下流向HMP的代谢流为12.74,合成组氨酸的代谢流为9.61。结论：在发酵初期添加柠檬酸钠能够改变L-组氨酸生物合成途径的关键节点6-磷酸葡萄糖、丙酮酸及乙酰辅酶A的代谢流分布,保持糖酵解途径、三羧酸循环与HMP之间代谢流量平衡,有利于提高L-组氨酸生物合成途径的代谢流量,最终使流向组氨酸的代谢流增加了7.86%。     

5-HT和DA对虾蟹打斗行为影响的研究进展

5-羟色胺(5-HT)和多巴胺(DA)是两种神经递质,可与众多不同类型的受体结合发挥多种重要的生理功能.现已证明其广泛分布于多种动物的不同组织中,在动物的打斗行为活动中起着重要的调节作用.目前,在虾蟹中已被报道的5-HT受体主要有5种,分别是5-HT1A、5-HT1B、5HT2A、5HT2B和5-HT7;DA受体主要为DA1A、DA1B、DA2和DA4.5-HT和DA及其受体分布存在明显的种属和组织特异性.5-HT和DA参于了虾蟹打斗行为的调节过程并有不同的调节机理.5-HT可以调节环磷酸腺苷(cAMP)或高血糖激素(CHH)的释放,促进或抑制虾蟹打斗行为;而DA同样能够通过调节cAMP及COMT等物质的释放来调节虾蟹打斗行为.     

耐氧突变株对中药射干中鸢尾黄素的生物转化

中药射干的甲醇提取物直接酸水解即得底物鸢尾黄素。通过本研究发现,耐氧突变株Sharpea sp.strain Aeroto-Niu-O16在有氧条件下能将底物鸢尾黄素(tectorigenin)进行转化。根据产物的质谱及核磁共振氢谱和碳谱等测定结果,将菌株转化鸢尾黄素所生成的产物鉴定为二氢鸢尾黄素(dihydrotectorigenin)。耐氧突变株Aeroto-Niu-O16对底物鸢尾黄素粗品的最佳转化时间为36~48 h,对底物鸢尾黄素粗品的最大转化浓度为0.8mmol/L,平均转化率为41.2%;当向培养基中添加0.15%(m/v)的L-半胱氨酸时,底物鸢尾黄素的平均转化率可由原来的41.2%提高到50.7%。利用微生物转化法合成二氢鸢尾黄素尚属国内外首次报道,本研究为日后生物合成二氢鸢尾黄素提供了可能。     

代谢副产物乙酸对L-色氨酸发酵的影响

分析了重组大肠杆菌(E.coli TRTH/pSV-709)发酵生产L-色氨酸的发酵过程,检测结果表明发酵液中有大量代谢副产物乙酸的积累。利用外源添加试验研究了乙酸对L-色氨酸发酵的影响,结果表明乙酸浓度高于2g/L时对L-色氨酸生产菌的生长和产酸均有抑制作用。分析了乙酸的产生机制,并采取了调节溶氧水平、确定合适初始葡萄糖浓度、限制葡萄糖流加及控制菌体比生长速率等措施来减少乙酸的生成。在优化条件下,乙酸含量与原工艺相比降低了51.35%,菌体生物量和L-色氨酸产量分别提高了51.07%和46.54%,实现了高密度发酵培养的目的。     

敲除aceE基因对大肠杆菌生长和丙酮酸代谢的影响

大肠杆菌aceE基因是编码丙酮酸脱氢酶多酶复合体PdhR的关键酶之一。利用Red重组系统敲除大肠杆菌MG1655的aceE基因后,阻断了丙酮酸流向TCA循环,导致丙酮酸的累积,也使菌体生长受到影响,在培养基中补加5 g/L KAc后可以在一定程度上弥补菌株在生长上的缺陷。摇瓶发酵36 h,MG1655没有积累丙酮酸,MG1655ΔaceE∷cat菌株可以积累26.77 g/L丙酮酸,为利用大肠杆菌发酵生产丙酮酸奠定了基础。     

乙酸对重组大肠杆菌生长及外源基因表达的影响

在重组基因工程菌ＤＨ５α（ＰＧ－ＦＧＦ）的高密度培养过程中,发现培养液中有大量代谢副产物－乙酸的产生和积累,乙酸的存在抑制了工程菌的生长及外源基因的表达。研究了乙酸在Ｍｇ培养基中对工程菌ＤＨ５α（ＰＧ－ＦＧＦ）生长及外源基因表达的影响。结果表明,乙酸的存在不仅导致重组菌生长速率的降低及延迟期的增长,而且对外源基因产物的表达具有强烈的抑制作用,这为该工程菌的高密度培养及外源基因产物的高表达打下了基础。     

温度对鳊鱼静止代谢和耐低氧能力的影响

以鳊鱼(Parabramis pekinensis)幼鱼[体重(8.13±0.15)g,n=31]为研究对象,以密闭式代谢测定法分别在15、20、25、30℃条件下测定其静止代谢率(Rest Metabolic Rate,RMR),并以双线法推算临界氧浓度Pcrit等相关参数。结果显示,鳊鱼幼鱼的静止代谢水平呈随温度上升而升高的变化趋势[(132.22±4.97)mg O2/(h.kg)(15℃),(182.67±12.49)mg O2/(h.kg)(20℃),(218.44±9.20)mgO2/(h.kg)(25℃),(298.32±9.96)mg O2/(h.kg)(30℃)],除20～25℃间,其他各温度组差异显著(P0.05);Q10值均低于2(15～20℃1.91,20～25℃1.43,25～30℃1.87);本研究还发现,随着温度的升高,鳊鱼幼鱼的Pcrit逐渐下降,而临界氧饱和度Scrit则相对保守[15、20、25、30℃的Pcrit分别为(1.35±0.09)、(1.16±0.19)、(0.97±0.12)和(0.86±0.09)mg O2/L,Scrit分别为13.87%±0.74%、13.32%±1.72%、12.15%±1.35%和11.34%±0.65%。这表明,采用不同指标考察鱼类耐低氧能力可能会得到相异的结论。这种结论的不一致提示,在鱼类应对环境溶氧降低的适应中,相对溶氧水平而不是绝对溶氧水平影响并决定着鱼类的适应性进化,因此采用相对饱和度作为指标研究鱼类耐低氧能力可能更具理论价值。     

水稻永绿色基因超表达和突变对其叶片氮碳代谢若干指标的影响

通过水培实验,研究了水稻永绿色(Stay-green rice,SGR)基因超表达和突变对叶片氮碳代谢的影响。结果表明,在正常生长条件下,SGR基因超表达降低了水稻叶片可溶性蛋白、叶绿素及淀粉的含量,但可溶性糖和游离氨基酸含量增加,并提高了谷氨酰胺合成酶(GS)活性和谷氨酸合成酶(GOGAT)活性;SGR基因突变增加了水稻叶片淀粉和可溶性蛋白质含量,并提高了硝酸还原酶(NR)活性。在缺氮条件下,SGR基因超表达与野生型叶片各生理指标的变化趋势一致,但是SGR基因突变体叶片中淀粉含量的变化趋势与野生型及SGR基因超表达的不一致。这说明SGR蛋白水平的变化在一定程度上影响了水稻叶片的氮碳代谢。     

RAB5A蛋白G81R位点突变对其功能的影响

为探讨G81R位点突变对RAB5A蛋白功能的影响,将RAB5A G81R突变体和正常RAB5A反义RNA分别插入pcDNA3．1／V5-His TOPO真核表达载体,并转染到Anip973细胞。用Western blot方法检测稳定转染后细胞RAB5A蛋白的表达水平,通过血清饥饿法使Anip973和转染后的细胞同步化,停滞于G0～G1期,再恢复血清培养使细胞从G0～G1期释放,用流式细胞分析仪分析细胞周期各时相细胞百分比。结果显示RAB5A G81R突变体的反义RNA可完全封闭Anip973细胞中RAB5A的表达,正常RAB5A反义RNA部分封闭RAB5A表达。并且,Anip973细胞周期的长短与RAB5A的表达程度成反比。RAB5A G81R反义RNA能够有效地阻断Anip973细胞中RAB5A蛋白的表达。阻断或降低RAB5A的表达可延长细胞周期。     

耐辐射奇球菌dps突变株的构建和蛋白功能初步研究

Dps(DNAprotection during starvation)蛋白是原核生物中特有的一类具有铁离子结合和抗氧化损伤功能的重要蛋白。利用体外PCR扩增技术和体内同源重组方法,获得了耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans)dps全基因(DRB0092)缺失突变株。对突变株和野生型分别进行不同浓度过氧化氢(H2O2)处理,结果表明:与野生型菌株R1相比,dps突变株在低浓度H2O2(≤10mmol/L)条件下存活率急剧下降,而高浓度(≥30mmol/L)下则完全致死。Native-PAGE活性染色结果显示,稳定生长期dps突变株体内两种过氧化氢酶(KatA和KatB)的活性较野生型R1分别上调2.3倍和2.6倍。通过质粒构建和大肠杆菌诱导表达,获得可溶性Dps蛋白。体外结合和DNA保护实验结果显示:Dps具有明显的DNA结合功能,并能保护质粒DNA免受羟自由基攻击。本研究证明,Dps蛋白在耐辐射奇球菌抗氧化体系中发挥重要作用,可能对该菌极端抗性机制有重要贡献。