青霉素G酰化酶操纵子的负调控因子的研究

青霉素G酰化酶(PA)操纵子的调节基因(pacR)存在于青霉素G酰化酶结构基因(pac)内部Dral-Taql一段约500bp的DNA片段内,此片段内含有2个ORF。2个ORF及其突变体分别克隆到pUC18得到一系列重组质粒,用这些重组质粒转化青霉素G酰化酶产生菌E.coliD816,测定克隆片段对PA表达的影响。如果克隆片段含有具功能的pacR,诱导剂苯乙酸(PAA)不能使由高拷贝却pacR表达的阻抑物全部失活,部分阻抑物结合pac操纵基因,阻碍RNA聚合酶对pac的转录,因此PA的表达量降低。结果表明,阻抑物是由pac结构基因内部的ORF2编码的蛋白因子,pacR即ORF2。RNA—DNA杂交实验证实了pacR在转录水平阻抑pac的表达。     

青霉素G酰化酶基因Ser177的定点突变

本研究用缺口以链法对肠杆菌青霉素Ｇ酰化酶（ＰＧＡ）基因Ｓｅｒ１７７进行寡核苷酸定点突变。通过ＮＩＰＡＢ（２－硝基－５－苯乙酰胺苯甲酸）试纸法筛选和测序鉴定,获得突变体Ｃｙｓ１７７,Ｇｌｙ１７７,Ａｒｇ１７７和Ａｓｎ１７７。它们的ＰＧＡ活性均已丧失。酶蛋白电泳分析表明突变体蛋白在体内正常表达。推测ＰＧＡ Ｓｅｒ１７７秀可能位于酶底物结合中心,是酶活性所必需,不能被置换。     

大肠杆菌青霉素G酰化酶基因及其邻近区域的核苷酸全序列

Some of microorganisms have been known to possess penicillin G acylase activity. The E. coli derived penicillin G acylase (PGA) can catalyze the conversion of penicillin G into phenylacetic acid and 6-amino-penicillanic acid, the latter is used as the starting compound for the industrial formation of semi-synthetic penicillins. Apart from its industrial importance, the enzyme PGA displays a number of interesting properties. Catalytically active enzyme is localized in the periplasmic space of E. coli cells and composed of two dissimilar subunits. The two subunits are apparently produced from a precursor protein, via a processing pathway hitherto unique in its features for a prokaryotic enzyme. The studies on processing of the precursor and on the relationship between structure and function of the mature enzyme are important theoretically. Previously we cloned a 3.5 kb DNA fragment from a strain (E. coli AS 1.76), which displays PGA activity. In this paper, we report a nucleotide sequence of the 3.5 kb DNA fragment containing PGA gene. After insertion of the DNA fragment into EcoR I and Hind III sites in pWR 13, pPGA 20 had been obtained. We subcloned the Hind III and Bg1 II treated fragment of 1.6 kb in length from pPGA 20 into Hind III and BamH I sites of pWR 13 to get a pPGA 1.6, and Bg1 II and EcoR I treated fragment of 1.9 kb in length into BamH I and EcoR I sites of pWR 13 to get a pPGA 1.9. The linearized pPGA 1.9 which were digested with appropriate restriction enzymes were progressively shortened from both ends respectively by digestion with Bal 31 nuclease, followed by cleavage of shortened target DNA off vector DNA molecules with appropriate restriction enzymes. The series of the DNA fragments shortened from EcoR I end were then cloned into plasmid pWR 13 which had previously digested with Hind III and Sma I enzymes (Fig. 1). The DNA fragment cloned in pWR 13 were directly sequenced on the resulted plasmids by using primer I and primer II. Thus we have obtained the complete nucleotide sequence of the 3.5 kb DNA fragment. The 3.5 kb fragment contains an intact PGA gene which is 2.6 kb.(ABSTRACT TRUNCATED AT 400 WORDS)     

温度对大肠杆菌青霉素G酰化酶基因表达的影响

含有大肠杆菌青霉素G酰化酶基因的质粒pWGA在菌株DH5α中表达时,表现为温度敏感。在30℃和37℃两种培养温度下,用Northern Blot和Western Blot研究了菌体的转录水平和翻译水平。结果表明菌体培养温度升高不影响mRNA的转录,但不利于青霉素酰化酶前体蛋白的正确加工,导致青霉素酰化酶在37℃发酵生产时酶活力单位的下降。     

硅藻土在青霉素G酰化酶提纯中的应用

国产硅藻土经氢氧化铵处理后可用于从发酰液中直接取青霉素Ｇ酰化酶,平均吸附量为９０Ｕ／ｇ。吸附的酶可用２２％硫酸胺－０．３ｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ（ｐＨ８．０）溶液洗脱。平均比活１８Ｕ／ｍｇ蛋白（ＮＩＰＡＢ法）。硅藻土可反复使用。苯乙酰胺－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ树脂可对酶作进一步的纯化。     

化学修饰对青霉素G酰化酶活性的影响

为进一步阐明大肠杆菌AE 109青霉素G酰化酶(PA,E.C.3.5.1.11)的结构与功能关系,研究了数种修饰剂对酶活性的影响;同时测定了四种作用物存在下对各修饰剂修饰酶的影响。结果表明Ser残基处于酶的活性部位,Met残基可能处于与底物结合的部位,His和Cys残基与酶的活性无关。     

大肠杆菌AS1.76青霉素G酰化酶基因的克隆和定位

通过DNA体外重组,由E. colt AS 1.76菌株染色体DNA获得了青霉素G酰化酶基因克隆。测定了pPGA20质柱的限制性内切酶图谱,并构建了若干个pPGA2(／的变种。这些变种的酶活力及其酶切位点关系的分析结果表明,青霉素G酰化酶基因定位在 HindIII 和Sinai酶切位点之间小于2．8Kb DNA片段上。     

一步法纯化青霉素G酰化酶

本文报导了用水平等电聚焦电泳技术由粗酶液一步纯化制得纯青霉素G酰化酶.     

定点突变提高青霉素G酰化酶的稳定性

以大肠杆菌青霉素G酰化酶的晶体结构为模板 ,用软件PMODELING同源模建巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶的三维结构。在此基础上 ,将 β亚基 4 2 7位 (突变A)和 4 3 0位 (突变B)赖氨酸残基突变为丙氨酸 ,降低了该酶的等电点 ,增加了疏水性 ,从而提高其在酸性和有机溶剂环境中的稳定性。两个突变体与亲本相比 ,比活力和Km相近 ,最适pH减少了 0 .5个单位 ,突变B在 pH 5 .2的溶液中的稳定性明显提高。突变A和B在 15 %DMF中的半衰期分别比亲本酶提高了 60 %和 166%     

巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶基因在枯草杆菌中的高表达

用ＰＣＲ方法从巨大芽孢杆菌的基因组ＤＮＡ中扩增到青霉素Ｇ酰化酶基因,并装载到枯草杆菌质粒ｐＰＺＷ１０３中,将其转化到枯草杆菌ＤＢ１０４中进行了分泌表达,重组菌株产酶无需苯乙酸诱导。在３７℃培养２４ｈ,菌液酶活力可达６ｕ／ｍｌ。１０天的连续传代实验表明重组菌株的稳定性很高。     

青霉素G酰化酶调节基因的定位

为了定位青霉素G酰化酶的调节基因,从质粒Ppa6克隆了一系列青霉索G酰化酶基因(pac)的片段,将这些重组质粒转化E.coli D816,测定克隆片段对pac表达的影响。如果克隆片段含有完整的调节基因(pacR)。诱导剂不能使由高拷贝pacR表达的阻抑物失活,部分阻抑物结合pac操纵基困,阻碍RNA聚合酶对加pac的转录,因此pac的表达量降低。发酵结果表明,阻抑物可能是由pac结构基因内部的ORFⅡ编码的蛋白因子。     

大肠杆菌中青霉素G酰化酶成熟的限制性因素

为了研究大肠杆菌中青霉素G酰化酶 (PenicillinGacylase ,PAC)成熟的限制性步骤 ,分别构建了PAC表达质粒pKKpacSP ,pETpacSP ,并将它们在大肠杆菌宿主中表达。通过酶活性的测定及Westernblotting分析 ,分别在PAC自身表达系统 ,Tac ,T7及氧调控表达系统中 ,研究PAC前体蛋白加工成α亚基、β亚基的效率及亚基折叠组装形成活性酶的能力。结果表明 :PAC成熟过程中的限制性步骤因宿主 载体系统而异 ;PAC本身表达系统中 ,前体肽加工成α亚基、β亚基的效率为 57.2 % ,亚基组装能力为 0.72;Tac启动子表达调控系统中α亚基的折叠和稳定成为限制性步骤 ;T7及氧调控表达系统中 ,PAC前体肽加工成α亚基、β亚基的效率达 90 %左右 ,亚基组装成活性酶的能力分别为 1 82 ,2 ;低氧调控系统表达PAC时 ,成熟的效率最高 ,PAC表达的单位重量活性提高 10倍.     

重组青霉素G酰化酶在枯草芽孢杆菌中的表达条件优化

 为获得巨大芽孢杆菌青霉素 G酰化酶 (PGA)的高产菌株和条件 ,构建了分泌表达 PGA的基因工程枯草杆菌菌株 ,对表达条件进行了优化 .以 LB作为初始培养基 ,考察了温度、苯乙酸、装液量、碳源对于工程菌 PGA产量的影响 .实验发现重组细胞产酶不再需要变温和苯乙酸诱导 .充足的通气量和适当浓度的淀粉可使细胞密度及 PGA表达量大为提高 .表达条件优化后 ,菌体 A60 0由 3提高到 2 0 ,PGA的表达量由 3～ 6U/ml提高到 35～ 40 U/ml,为目前生产用巨大芽孢杆菌表达量的 6倍 .     

青霉素酰化酶及其突变体的pH依赖性催化反应

运用动力学方法对巨大芽孢杆菌 (Bacillusmegaterium)来源的重组青霉素G酰化酶及其突变体的 pH依赖性催化反应机制进行了研究 ,从logVm和log(Vm/Km)与 pH关系曲线计算得到野生型青霉素G酰化酶参与催化反应的离子化基团的 pK1和 pK2 分别为 5 .5 0～ 5 .87和 10 .73。研究结果表明 ,两种突变体的 pK1和 pK2 值与野生型很接近 ,突变体A和B的pK1分别为 5 .6 4～ 5 .86和 5 .6 9～ 6 .96 ,pK2 分别为 10 .6 1和 10 .4 8。与此同时还考察了不同反应温度时野生型青霉素G酰化酶的 pK1和pK2 值 ,从 pK1和 pK2 与温度的关系曲线计算可得离子化基团的解离热焓ΔH分别为 4 4 .38～ 5 9.0 3kJ/mol和 14 7.37kJ/mol。根据上述实验结果 ,推测两个参与催化反应的离子化基团可能是位于活性中心附近的组氨酸和赖氨酸。     

粪产碱杆菌青霉素G酰化酶在枯草芽孢杆菌中的表达、纯化及其性质

利用PCR技术克隆了粪产碱杆菌 (Alcaligenesfaecalis,CICCAS1.76 7)青霉素G酰化酶 (pencillinGacylase ,PGA)基因 (GenBank登录号AF4 5 5 35 6 )。通过构建工程菌E .coli(pETAPGA) ,该酶在大肠杆菌中获得了表达 ,表达产物分泌到周质空间。进一步构建的工程菌B .subtilis (pMAPGA)和B .subtilis(pBAPGA)实现了该酶的胞外分泌表达。分泌表达的最高表达量为 6 5 3u/L ,比野生型A .faecalis表达量高 10 9倍。表达产物经硫酸铵分级沉淀和DEAE SepharoseCL 6B两步纯化 ,纯度提高 86倍 ,活力回收率达到 81% ,纯化后的PGA活力为 1.4 6 9u/mg。研究表明 ,PGA家族成员中只有粪产碱杆菌PGA和巨大芽孢杆菌PGA可以在枯草芽孢杆菌中分泌表达。与巨大芽孢杆菌PGA相比 ,粪产碱杆菌PGA的最适pH值为 8.0 ,最适温度为 6 0°C ,而且在有机溶剂中具有更强的稳定性。该酶在水相中具有较低的头孢氨苄合成活力。本研究为粪产碱杆菌PGA的获得提供了新的途径。     

活性炭吸附固定化粪产碱杆菌青霉素G酰化酶

目的：以活性炭为载体固定化粪产碱杆菌来源的青霉素G酰化酶,考察固定化酶的性质。方法：对影响酶固定化的因素优化筛选,确定有显著影响的因素：pH、离子强度、酶量、固定化时间进行L934的正交实验,获得最佳固定化条件,并对固定化酶的最适反应温度、pH及批次稳定性进行研究。结果：最佳固定化条件为：载体0.3g,酶量5mL,总反应体系为12mL,离子强度1mol/L,温度4℃,pH 7.0,固定化40h;最高固定化酶活性为135.9U/g湿载体。固定化酶性最适反应温度为55℃,最适pH为10,重复使用12次后没有活性损失。结论：活性炭吸附固定化青霉素G酰化酶的活性高,批次反应稳定,具有工业应用潜力。     

组成型表达粪产碱杆菌青霉素G酰化酶重组大肠杆菌发酵条件研究

目的:对重组大肠杆菌组成型表达粪产碱杆菌青霉素G酰化酶(AfPGA)进行了发酵条件研究。方法:在摇瓶和5L发酵罐中研究了(NH4)2SO4和葡萄糖浓度对质粒的分离稳定性及青霉素G酰化酶表达的影响。结果:该工程菌质粒具有分离不稳定性,培养基中无(NH4)2SO4时发酵过程中pH和糊精水解生成葡萄糖的浓度变化较小,细胞前期(0h-12h)的生长速率降低,质粒分离稳定性和青霉素G酰化酶的表达水平提高。发酵过程中维持低葡萄糖水平可以限制细胞的生长速率,提高质粒稳定性和促进青霉素G酰化酶的合成。采用混合碳源发酵,发酵培养基含糊精2g/L,12h后以1g/L.h恒速流加葡萄糖至35h,控制流加过程葡萄糖浓度0.1g/L左右,平均比生长速率为0.06h-1,发酵结束时质粒稳定性为86%,青霉素G酰化酶的表达水平达23 000U/L。结论:重组大肠杆菌组成型表达青霉素G酰化酶的研究对工业生产有一定指导意义。