虎纹捕鸟蛛毒液中透明质酸酶的纯化和部分性质的研究

用分子筛（岛津ＤＩＯＬ－１５０柱）和阳离子交换（岛津ＷＣＸ－１柱）高效液相色谱从虎纹捕鸟蛛（Ｓｅｌｅｎｏｃｏｓｍｉａｈｕｗｅｎａ）毒液中分离提纯透明质酸酶（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ,ＥＣ３．２．１．３５）．经等电聚焦电泳为一条带,ｐＩ＝７．２．经ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳测得分子量为４０ｋＤ,经凝胶过滤测得分子量为４０．７ｋＤ。以透明质酸为底物时在ｐＨ３．５─５．５范围内有较大活性,最适ｐＨ值为４．０;在ｐＨ４．５─６．０范围内稳定,在反应温度为３０─６０℃时有较大活性,最适温度为５０℃;对热稳定,０．１５ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣｌ对酶活性有一定的稳定作用．３％的肝素、５００μｍｏｌ／Ｌ的Ｈｇ~（２＋）、Ｆｅ~（２＋）、Ｃｕ~（２＋）对酶活性有明显的抑制作用。     

人脑及红细胞膜乙酰胆碱酯酶的芳基酰胺酶活性

采用联合亲和层析法从人小脑及红细胞膜中纯化了ＡＣｈＥ,纯化的人脑及红细胞ＡＣｈＥ在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上呈一主带,分子量约为６６０００。人脑ＡＣｈＥ制备酯酶与酰胺酶比活性分别为１２９９与１４３Ｕ／ｍｇ,人红细胞ＡＣｈＥ制备分别为４５８４与７４７Ｕ／ｍｇ。人脑及红细胞ＡＣｈＥ制备的酯酶与酰胺酶活性最适ｐＨ较接近,在ｐＨ７．５－８．０之间,酯酶活性底物ＡＴＣｈ对其芳基酰胺酶活性有抑制作用。ＩＣ_（５０）分别为１０．２×１０~（－３）及３×１０~（－３）ｍｏｌ／Ｌ。梭曼对其酯酶及酰胺酶活性均有明显抑制作用,说明二者均需活性中心丝氨酸参与。     

麻蝇幼虫肠道蛋白酶BGP的分离纯化及性质

棕尾别麻蝇幼虫肠液经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ后,Ｘ光片显影,呈现两条蛋白酶活性带．ＩＥＦ后,两条蛋白酶活性带的等电点分别为ｐＨ７．７和６．８．麻蝇幼虫肠液经５５％～７５％硫酸铵沉淀,以及连续两次制备等电聚焦,分离纯化出等电点约为ｐＨ７．７,分子量约为３５ｋＤ的蛋白酶ＢＧＰ．该酶能分解酪蛋白和类胰蛋白酶专一底物Ｂｚ－Ｐｈｅ－Ｖａｌ－ＡｒｇＮＡ,不能分解弹性蛋白酶专一底物ｅｌａｓｔｉｎ－ＣｏｎｇｏＲｅｄ和类胰凝乳蛋白酶专一底物Ｓｕｃ（Ａｌａ）２Ｐｒｏ－ＰｈｅＮＡ．ＳＢＢＩ,Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ和ＰＭＳＦ能强烈抑制其活性．专一底物和抑制剂的结果表明,ＢＧＰ是一种类胰蛋白酶．其最适反应温度为５０℃,最适作用ｐＨ为８．５．不耐高温,５０℃保温３０ｍｉｎ活性急剧下降．Ｈｇ２＋,Ｚｎ２＋和Ｃｕ２＋能抑制酶活性．Ｃａ２＋,Ｍｇ２＋对酶无激活作用,ＥＤＴＡ无抑制作用．     

中温碱性脂肪酶的研究：Ⅲ.扩展青霉PF868变株碱性脂肪酶的纯化及其…

扩展青霉ＰＦ８６８变株发酵液经硫酸铵盐析和Ｓｅｐｈａｄｅｘ－Ｇ－２００及Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ柱层析纯化,获得纯化倍数为３２．４的酶粉。该酶分子量为２３４４２Ｄａｌ,酶学特性表明：该酶的最适作用温度为３２℃,５０℃保温３０ｍｉｎ仍保留５０％酶活性,最适ｐＨ为９．０,作用ｐＨ稳定范围在７．０－１０．０之间,Ｃａ＾２＋和Ｍｇ＾２＋对酶有激活作用,Ｆｅ＾２＋,Ｃｕ＾２＋和Ｍｎ＾２＋酶活力有抑制作用。     

高血压大鼠红细胞膜Ca~（2＋），Mg~（2＋）─ATP酶对Ca~（2＋）反应的变化及Mg~（2＋）的作用

本实验观察了正常及高血压大鼠红细胞膜Ｃａ２＋,Ｍｇ２＋－ＡＴＰ酶对不同浓度Ｃａ２＋及Ｍｇ２＋的反应。结果表明：（１）在自发性高血压大鼠（ＳＨＲ）,此酶最适反应的Ｃａ２＋浓度为１０－６ｍｏｌ／Ｌ;ＷＫＹ大鼠为１０－４ｍｏｌ／Ｌ;两肾一环型肾性高血压大鼠（ＲＨＲ）为１０－７ｍｏｌ／Ｌ,Ｗｉｓｔａｒ大鼠为１０－４ｍｏｌ／Ｌ,Ｃａ２＋高于以上各相应浓度时该酶活性受到抑制;（２）作为该酶激动剂的Ｍｇ２＋有其最适激活浓度,在ＷＫＹ大鼠、ＲＨＲ及Ｗｉｓｔａｒ大鼠均为４．５ｍｏｌ／Ｌ;（３）高浓度Ｍｇ２＋（３６．０ｍｏｌ／Ｌ）可以逆转高浓度Ｃａ２＋对该酶的抑制作用。以上结果表明,底物Ｃａ２＋浓度的变化对Ｃａ２＋,Ｍｇ２＋－ＡＴＰ酶的催化活性影响极大,该酶活性的促发及维持必须有适宜浓度的Ｍｇ２＋。高血压时此酶对Ｃａ２＋的敏感性增高,且Ｍｇ２＋对酶保护作用更为明显。本结果提示,胞内高浓度Ｃａ２＋不仅是高血压发生的原因之一,并可能与其发展及恶化有关。     

背角无齿蚌碱性碳酸酶的分离、纯化及其动力学研究

作者对背角无齿蚌外套膜的碱性磷酸酶（ＡＫＰ）进行了分离纯化,并对其动力学性质进行了初步研究。外套膜匀浆,经正丁醇抽提、盐析、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ—１００凝胶过滤等步骤,得到了比活力为１４９．６单位／ｍｇ蛋白的酶制品。通过动力学方法测得其最适ｐＨ值为９．５,最适温度为４０℃,以磷酸苯二钠作底物的Ｋｍ值为０．５７ｍｍｏｌ／Ｌ。Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋对酶有激活作用,而Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、ＫＨ２ＰＯ４、ＥＤＴＡ和巯基乙醇有抑制作用。     

彩绒革盖菌愈创木酚氧化酶活性研究

本文测定了彩绒革盖菌在ＰＤＹ液体培养基中的愈创木酚氧化酶活性。在３０℃,１１０ｒ／ｍｉｎ,恒温振荡培养条件下,第１６天达产酶高峰,酶活性２１８．０ｕ;酶作用的最适ｐＨ为４．０;最适温度３０℃;Ｂａ＾２＋、Ｍｇ＾２＋、Ｃｕ＾２＋等离子对愈创木酚氧化酶有激活作用,Ａｇ＾＋离子对酶活性有明显的抑制作用。     

水稻叶片磷酸烯醇式丙酮酸磷酸酯酶活性及其部分特性

从水稻（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）叶片分离出对磷酸烯醇式丙酮酸（ＰＥＰ）较专一的ＰＥＰ磷酸酯酶,其Ｋｍ （ＰＥＰ）为０．４２ ｍ ｍ ｏｌ／Ｌ,作用ｐＨ范围较窄,最适ｐＨ ８．７。它在ｐＨ ６．２—９．５ 范围内及４０℃以下较稳定。Ｐｉ对酶活性影响不大,仅在大于５ ｍ ｍ ｏｌ／Ｌ时表现出轻微的抑制作用。Ｍｇ２＋ 对酶活性具激活作用,在Ｍｇ２＋ 存在条件下,ＣａＣｌ２、ＣｏＣｌ２、ＣｕＳＯ４、ＦｅＳＯ４ 和ＺｎＳＯ４ 均表现抑制作用     

背角无齿蚌碱性磷酸酶的分离,纯化及其动力学研究

作者对背角无齿蚌外套膜的碱性磷酸酶（ＡＫＰ）进行了分离纯化,并对其动力学性质进行了初步研究,外套膜匀浆,经正丁醇抽提,盐析,ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００凝胶过滤等步骤,得到了比活力主国１４９．６单位／ｍｇ蛋白的酶制品,通过动力学方法测得其最适ｐＨ值为９．５,最适温度为４０℃,以磷酸苯二钠作底物的Ｋｍ值为０．５７ｍｍｏｌ／Ｌ,Ｍｇ＾２＋,Ｃａ＾２＋对酶有激活作用,而Ｃｕ＾２＋,Ｚｎ＾２＋,ＫＨ２ＰＯ４     

影响微小毛霉凝乳酶活力的因素

介绍影响微小毛霉凝乳酶活力的几个因素．该微小毛霉凝乳酶的最适ｐＨ在５．４～７．０范围;在ｐＨ２～７之间酶活保持稳定;凝乳酸最适温度在２５～７０℃,并随温度的增高酶活增大;６０℃处理１０ｍｉｎ酶活损失６８％,并随时间的延长酶活损失加大;Ｆｅ２＋、Ｍｇ２＋对酶有激活作用,Ｎａ＋、Ｃｕ２＋对酶有抑制作用。     

配体对(Na~++K~+)-ATP酶E_2→E_1转变的影响

 本研究确定了在0℃条件下,(Na~++K~+)-ATP酶纯化制备物与5mmol/L Na~+或Mg~(2+)在5mmol/L咪唑(pH7.4)环境中预保温30分钟,然后进行磷酸化,可以获得最高磷酸化水平,Na~+或Mg~(2+)的K_(0.5)值分别为0.29mmol/L或0.35mmol/L;以ADP代替Na~+和Mg~(2+)与酶预保温,对E_2向E_1转变无任何影响,而与Na~+、Mg~(2+)一起存在时则能加强Na~+及Mg~2的预保温效果。     

纳米TiO2、ZnO、SiO2对剑尾鱼肝组织中Na+/K+-ATP酶活性的影响

采用浸浴法研究了氧化纳米颗粒TiO2、ZnO、SiO2对剑尾鱼(Xiphophorus helleri)肝中Na+/K+-ATP酶活性的影响。结果表明:纳米TiO2处理组,高浓度(5 mg/L、10 mg/L)组表现为抑制作用,其中5 mg/L处理组Na+/K+-ATP酶的活性与对照组无显著差异(p>0.05),10 mg/L处理组中Na+/K+-ATP酶的活性显著低于对照组中酶的活性(p<0.05)。低浓度组(0.1 mg/L、1 mg/L)则表现为先诱导后抑制,除0.1 mg/L组在暴露1 d后与对照组有显著差异外(p<0.05),其余组与对照组均无显著差异(p>0.05)。纳米ZnO、SiO2处理组(0.1 mg/L、10 mg/L)在暴露1 d后,肝中Na+/K+-ATP酶的活性均比对照组高,随着暴露时间增加至20 d,Na+/K+-ATP酶活性下降,且显著低于对照组(p<0.05)。3种纳米颗粒的浓度为0.1 mg/L时,对暴露后1 d剑尾鱼肝中的Na+/K+-ATP酶活性的影响均为诱导作用,诱导大小顺序为ZnO>TiO2>SiO2;随着暴露时间的增加至10 d,纳米TiO2、ZnO、SiO2处理组对Na+/K+-ATP酶活性均表现出抑制作用。     

无机离子和有机溶质对α-淀粉酶热稳定性的影响

长期以来,如何提高酶蛋白的热稳定性是分子生物学、生物工程学、化学工业等所关注的重要研究课题之一。分析了多种无机离子、糖和氨基酸对枯草杆菌液化型α-淀粉酶热稳定性的影响以及它们的共存效应,获取了一些对相关研究领域具有理论参考和实际应用价值的实验结果。在无机盐中,1mmol/L的钙离子或50mmol/L的钠离子能显著地提高该酶的热稳定性;酸性氨基酸和碱性氨基酸表现出相反的结果：酸性氨基酸具有明显的增强作用,碱性氨基酸却使之降低;随着糖浓度的增加（0～1000mmol/L）,该淀粉酶的热稳定性呈线性增高;当钠离子或钾离子与某些氨基酸或糖类共同存在时,对该淀粉酶的热稳定性表现出了明显的协同作用。试图通过检测酶蛋白分子荧光强度改变来反映该酶的热稳定性变化,其结果是：随着温度的改变,酶蛋白的荧光强度的衰减与残余酶活性之间显示了良好的相关性。从而说明热环境使酶蛋白分子的螺旋结构发生变化而失活,某些溶质的存在可能是通过作用于蛋白质分子的立体结构而影响该酶的热稳定性。     

日本鳗鲡肠道N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质

为了探讨日本鳗鲡(Anguilla japonica)N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(EC3.2.1.52, NAGase)的分离纯化及其酶学性质, 通过硫酸铵沉淀分级分离、Sephadex G-100分子筛凝胶柱层析和DEAE-32离子交换柱层析纯化NAGase, 经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和SDS-PAGE鉴定酶的纯度、测定酶蛋白亚基分子质量; 以对-硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖为底物, 研究NAGase催化反应的动力学参数, 探讨其酶学性质。结果表明: 日本鳗鲡肠道NAGase纯酶制剂比活力为2517.40 U/mg, 酶蛋白亚基分子质量为69.98 kD, 酶的最适pH、最适温度、米氏常数K_m和最大反应速度V_max分别为6.0、60℃、0.336 mmol/L和7.634 μmol/(L·min); 酶在pH 4.8—7.2较稳定, 在温度60℃以下具有较好的热稳定性, 在65℃以上酶迅速失活。Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺...     

树状多节孢酸性磷酸酶的分离纯化与性质研究

树状多节孢Nodulisporium sylviforme是从东北红豆杉Taxus cuspidata分离、可产生紫杉醇的内生真菌。研究以树状多节孢为材料,利用液体发酵手段获得菌丝体,通过CM-cellulose阴离子交换柱层析、Q-Sepharose阳离子交换柱层析和FPLC凝胶过滤层析（Superdex 75）,获得纯化的树状多节孢酸性磷酸酶蛋白（Nod-ACP）。结合FPLC和SDS-PAGE分析,判定该磷酸酶为分子量44kDa单亚基蛋白。酶学性质研究表明,其最适pH值为3.0,最适温度为58℃。6     

产木聚糖酶白地霉培养特性及部分纯化的酶学特性

本文对白地霉Ref1的培养特性、产酶条件和酶学特性进行了初步研究。结果表明:该菌为低温型菌株,其最佳生长条件为pH6、20℃和酵母膏作为氮源;最佳产酶条件为pH3-7、15℃及以酵母膏氮源;条件优化后产酶可达118.7U/mL,可溶蛋白含量可达到60μg/mL,酶溶液的比活可达到1250U/mg蛋白质;该木聚糖酶的最适反应温度和pH分别为50℃和5,金属离子Mg2+、Na+和8mmol/L的Fe2+、Cu2+、Zn2+等对木聚糖酶的活性有抑制作用,而Ca2+、4mmol/L的Fe2+、Cu2+、Zn2+和8mmol/L的Mn2+等对该酶反应则有促进作用;该木聚糖酶在保温2h后在15-40℃范围内能保持80%以上的酶活性,在50℃时能保持68%的酶活性;用lineweaver-Burk作图法(双倒数作图法)求得该酶的最大反应速度Vmax和Km值分别为163.38mmol/mg/min和0.75mg/mL。     

豆壳过氧化物酶的分离纯化及其性质研究

从豆壳抽提液经硫酸铵分级沉淀,ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ－５０离子交换层析,ＣｏｎＡ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲合层析和Ｂｉｏ－ＧｅｌＰ－６０凝胶过滤,纯化了豆壳过氧化物酶（ｓｏｙｂｅａｎｈｕｌｐｅｒ－ｏｘｉｄａｓｅ,ＳｈＰ）．纯化酶的比活力为７０７７Ｕ／ｍｇ,在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上显示出一条蛋白质带．ＳｈＰ分子量为３８０００,等电点为３．９;ＳｈＰ为一含血红素的糖蛋白,含糖量为１８．７％,光谱学分析揭示,在４０６ｎｍ处有一典型的Ｓｏｒｅｔ带,在５１０ｎｍ和６４０ｎｍ处有特征吸收峰．酶反应的最适ｐＨ在４．０附近,最适温度为４５℃;在ｐＨ２．５～１２．０之间较稳定,７５℃,保温６０ｍｉｎ,酶活力残余６８％,ＳｈＰ是一种良好的耐酸碱、耐热过氧化物酶．动力学分析求得ＳｈＰ的表观Ｋｍ（愈创木酚）为１．６２ｍｍｏｌ／Ｌ,表现Ｋｍ（Ｈ２Ｏ２）为０．３４ｍｍｏｌ／Ｌ．在所测定的化学试剂中,Ｎ－３、ＣＮ－、Ｆｅ３＋、Ｆｅ２＋和Ｓｎ２＋对酶有较强烈的抑制作用,而重金属离子Ａｇ＋、Ｈｇ２＋、Ｐｂ２＋、Ｃｕ２＋、Ｃｒ３＋以及ＳＤＳ和ＥＤＴＡ对酶活力无显著影响     

嗜热脂肪芽孢杆菌β-半乳糖苷酶的性质

利用硫酸铵分级沉淀、离子交换层析 (DEAE- 2 2 )、Sephadex G- 75凝胶过滤从嗜热脂肪芽孢杆菌胞内提纯得到 β-半乳糖苷酶。研究表明 ,该酶最适表观反应温度和最适 pH分别为 6 0℃和 6 .4。在 50℃该酶具有良好的热稳定性。碱金属和碱土金属盐对酶有激活作用 ,重金属 Zn²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺抑制酶的活力。巯基保护剂能明显增强酶的活力 ,而巯基结合试剂强烈抑制酶的活性。该酶对 β-     

酿脓链球菌Cas9核酸酶的重组表达、分离纯化及酶学特性

【背景】Cas9核酸酶是一种RNA引导的核酸内切酶,可与单链向导RNA (single-guide RNA,sgRNA)形成稳定的核糖核蛋白复合物,识别和切割特定的核苷酸片段。由于其具备高灵活性和高效率的特点,目前已经成为基础科学研究领域和临床治疗方法中使用最广泛的基因编辑工具。【目的】为Cas9核酸酶的合理开发和利用提供理论依据。【方法】利用大肠杆菌表达系统表达野生型酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes) Cas9核酸酶,经硫酸铵沉淀和镍柱亲和层析两步纯化获得较高纯度表达产物,并对其热稳定性、pH稳定性、金属离子的影响等酶学特性进行研究。【结果】经高密度发酵后,大肠杆菌湿菌重达191.0 g/L。纯化后酿脓链球菌Cas9核酸酶的比酶活达641.29 U/mg,纯化倍数为16.02,收率为46.40%。Cas9核酸酶在25-42°C保温2 h后剩余酶活保持在65%以上,而在45°C保温15 min后全部失活;其在pH 6.0-10.0范围内稳定性较高,剩余酶活大于68%,在pH9.0时稳定性最高;0.5-20.0mmol/L浓度范围内的Mg~(2+)对该酶有激活作用,10.0 mmol/L的Mg~(2+)可使该酶酶活力提高约23%;Ba~(2+)、Co~(2+)、Ca~(2+)、Mn~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(2+)、Zn~(2+)对该酶有不同程度的抑制作用,其中0.5 mmol/L的Cu~(2+)和Fe~(2+)对Cas9核酸酶有完全抑制作用。【结论】异源表达并纯化出具有较高纯度和较高酶活力的酿脓链球菌Cas9核酸酶,并对其酶学特性进行了初步研究,该结果对CRISPR/Cas9技术的进一步推广和应用有一定的指导意义。     

大鼠心肌肌浆网的纯化及其性质研究

 用超声波破碎心肌细胞,差速离心法纯化大鼠心肌肌浆网(CSR)。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得Ca~(2+)-ATPase分子量为98kD;电镜观察膜制备为完整的CSR微囊;标志酶哇巴因敏感型Na~(+),K~(+)-ATPase和叠氮化钠敏感型Mg~(2+)-ATPase活性表明膜制备中肌膜含量很低,但仍有线粒体污染。 用~(45)Ca~(2+)示踪微孔滤膜法研究Ca~(2+)跨膜转运,CSRCa~(2+)蓄集最大值为57nmol/mg蛋白。CSR Ca~(2+)-ATPase在4℃—21℃和21℃—49℃两区间反应活化能不同,前者大于后者。酶的最适pH为7.4。以ATP为底物,该酶有两个表观Km值:Km_1为3.7μmol/LKm_2为713μmol/L。