液相色谱串联质谱法检测法布雷病样本的质量控制研究

法布雷病(FD)是一种罕见的X连锁隐性遗传的溶酶体贮积病.用于检测FD的常用生物学标志物之一是Lyso-GB3,它是一种脱乙酰基的神经酰胺三己糖苷,通常通过高灵敏和特异性的液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)进行分析.由于LC-MS/MS技术的复杂性,中国大多数医院仍无法自行建立LC-MS/MS对FD进行高效可靠的诊断.患者的样本需要在当地医院采集,然后送到中心实验室进行LC-MS/MS分析.样本经过漫长的运输和储存过程,可能会影响样本质量,从而影响诊断的准确性.我们首先建立并验证了一种新的LC-MS/MS方法以保证FD样本质量,研究了分析前变量对Lyso-GB3检测的影响.这些分析前变量包括血浆的储存温度和时间、血浆的冻融循环、血浆的溶血程度、全血的储存温度和时间,以及离心温度.最后,我们分析了86个FD样本和100个正常人样本,并对Lyso-GB3浓度和与FD疾病分型的关系进行了相关性研究.结果显示,当血浆在20℃下储存时,Lyso-GB3浓度在4 d后开始下降.此外,溶血会显著影响FD样品的质量,重度溶血导致Lyso-GB3浓度下降了57.8%,其他分析前变量对FD样品质量影响不大.本方法在使用分析前标准化操作流程下,筛查FD的灵敏度和特异度为100%,确保了检测的正确性;当Lyso-GB3浓度的cut-off值为55.15μg/L,鉴别经典型、非经典型患者的灵敏度和特异度为71%和100%,ROC曲线下面积为0.83.我们的研究结果有助于医学实验室操作程序的标准化,以保证FD样本的质量,并为临床判定中国法布雷病的分型提供依据.     

LC-MS/MS法测定大鼠血浆中的野黄芩苷含量

目的:建立LC-MS/MS的分析方法测定大鼠血浆中的野黄芩苷,研究灯盏生脉胶囊中野黄芩苷在大鼠体内的药动学行为。方法:以噻氯匹定为内标,血浆样品经1%甲酸乙腈沉淀蛋白处理后,用LC-MS/MS法测定血浆中的野黄芩苷浓度。结果:野黄芩苷线性范围为1.31～670.00 ng·mL-1(γ0.999),最低定量浓度为1.31 ng·mL-1,回收率、日内、日间考察均符合生物样品分析要求。实验结果显示,野黄芩苷在大鼠体内出现多峰现象。结论:建立的LC-MS/MS定量分析方法灵敏、准确,可用于大鼠血浆中野黄芩苷的测定及其药代动力学研究。     

小型猪血浆中二丙酸倍他米松及其代谢物倍他米松的LC-MS/MS 同时测定方法的建立及在药动学研究中的应用

目的：建立同时测定小型猪血浆中二丙酸倍他米松及其代谢物倍他米松的LC-MS/MS 法,并研究小型猪皮肤外用二丙酸倍他米松乳膏后,二丙酸倍他米松及倍他米松的药动学特征。方法：血浆样品经酸化后以乙醚- 环己烷（4 ∶ 1）提取,LC-MS/MS 分析,以Hedera ODS-2（150 mm×2.1 mm,5 μm）为分析柱,流动相为5 mmol?L-1 醋酸铵水溶液（含0.1% 乙酸）– 甲醇,梯度洗脱。二丙酸倍他米松、倍他米松及内标布地奈德的监测离子对分别为m /z 563.2（[M+CH3COO]-）→ 483.1、m /z 451.2（[M+CH3COO]-）→ 361.0 和m /z 489.3（[M+CH3COO]-）→ 357.1。对小型猪外用二丙酸倍他米松乳膏后其血浆中二丙酸倍他米松及代谢物倍他米松的浓度进行测定,并计算主要药动学参数。结果：二丙酸倍他米松血药浓度在26.85~644.4 ng?L-1 范围内线性关系良好,倍他米松血药浓度在10.62~637.2 ng?L-1 范围内线性关系良好。结论：本方法专属性强、简便、灵敏,可用于血浆样本中二丙酸倍他米松及其代谢物倍他米松的测定及药动学研究。     

液相串联质谱法同时定量检测生物样本中鞘脂类化合物

鞘脂类中的主要活性分子鞘氨醇1-磷酸（S1P）,可通过介导细胞增殖、分化和迁移等发挥广泛的生物学功能|同时,S1P可在相关酶的作用下转变为其它形式.本文旨在建立一种简便的鞘脂类的制备方法,并结合液相串联质谱（LC-MS/MS）快速检测生物样本中纳克水平的鞘脂类化合物. 采用甲醇沉淀或经典的脂质提取方法获得鞘脂类化合物,再采用LC-MS/MS在多反应监测模式（MRM）下进行定量分析. 实验结果表明,甲醇沉淀法可简便快捷地获得血浆或脂蛋白中鞘氨醇类化合物; S1P、二氢鞘氨醇（DH-S1P）和鞘氨醇（SPH）的定量限分别为110.5、215.6和44.3 pg;人血浆中S1P、DH-S1P和SPH的含量分别为257.8±49.4 nmol/L、93.5±17.3 nmol/L和44.6± 7.4 nmol/L, 鞘脂类化合物在人血浆脂蛋白上的分布存在显著性差异|在ApoE-/-小鼠血浆中S1P、DH-S1P和SPH的含量分别为590.1±78.2 nmol/L、197.8±60.6 nmol/L和35.4±16.7 nmol/L|每1×106个人脐静脉内皮细胞（EA.hy926）中,S1P和SPH的含量分别为103.7±21.8 pg和16.3±5.3 ng.甲醇沉淀法结合LC-MS/MS可简便快捷地对血浆和脂蛋白中的鞘脂类化合物进行定量检测. 该方法特别适用于大量生物样本中鞘脂类的快速定量分析.     

LC-MS/MS法测定苦参提取物中苦参碱和氧化苦参碱的质量浓度

摘要 目的：探讨液相色谱/串联质谱法(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)测定苦参提取物中苦参碱和氧化苦参碱的质量浓度。方法：验证LC-MS/MS测定苦参提取物中苦参碱、氧化苦参碱的可行性与有效性,并判定检出限、重复性、稳定性、加样回收率。结果绘制苦参碱、氧化苦参碱的检出标准曲线。结果：LC-MS/MS检测苦参提取物中苦参碱与氧化苦参碱的一级质谱图和二级质谱图显示,苦参碱和氧化苦参碱的相对分子量为：248.36、246.36。色谱图显示苦参碱与氧化苦参碱无干扰色谱峰,各成分及内标峰形良好,表明该方法专属性强。在5 μg/L~500 μg/L浓度范围内,苦参碱、氧化苦参碱均呈现良好的线性关系,线性方程分别为y=6.10x-118.29和y=18.29x-14.22,检出限均为0.1 μg/L。LC-MS/MS法测定苦参提取物中苦参碱、氧化苦参碱的重复性、稳定性、加样回收率RSD均<5 %。结论：LC-MS/MS法测定苦参提取物中苦参碱和氧化苦参碱的质量浓度具有可行性、高灵敏度、高特异性等优点,可用于苦参提取物的质量控制与评价,并为后续他人的研究提供关键试验参考条件。     

检测小鼠肝炎病毒的SNaPshot分型技术及其应用

建立一种能对MHV_1、MHV_3、JHM、A_(59) 4种常见小鼠肝炎病毒(Murine Hepatitis Virus,MHV)进行分型检测的SNaPshot新方法。根据MHV 4种常见毒株基因序列比对结果,设计内外两对PCR通用引物和4个单碱基延伸引物,提取MHV 4种常见毒株RNA,逆转录后进行PCR扩增,纯化扩增产物,用SNaPshot方法进行单碱基延伸,将产物进行毛细管凝胶电泳,根据电泳结果分析毒株基因型。优化SNaPshot分析条件,进行灵敏度、特异性分析。用ELISA法和SNaPshot方法检测41例小鼠(Mus musculus)血清样本,将阳性样本进行克隆测序检测。当T1~T4引物修饰的poly T的数量分别为0、3、10和15,其浓度比为4︰6︰5︰10,引物大小分别为16 bp、19 bp、26 bp和31 bp时,SNa Phot分型检测MHV c DNA的最低浓度为1.25 mg/L,特异性为100%,与ELISA和T-克隆测序比较,其准确性为100%(41/41),阳性样本均为JHM毒株。实验结果说明,所建立的SNaPshot检测方法能对MHV_1、MHV_3、JHM、A_(59)进行分型检测,并且具有灵敏、特异、准确的优点。     

液相色谱-串联质谱法同时测定大鼠血浆中阿霉素和塞来昔布

目的:建立同时测定大鼠血浆中阿霉素和塞来昔布的液相色谱-串联质谱(LC/MS/MS)方法,研究这两种药物联合应用的药代动力学.方法:大鼠尾静脉注射阿霉素和塞来昔布,眼眶取血并抗凝,离心分离血浆,采用乙酸乙酯提取血浆中的阿霉素和塞来昔布,N2吹干乙酸乙酯,残留物用50μL甲醇溶解,取20μL用于LC/MS/MS分析.结果:用LC/MS/MS法检测大鼠血浆中阿霉素和塞来昔布的线性范围为1-800ng/mL,日内、日间精密度(RSD)均小于15%,检测血浆低、中、高三个浓度(8、50、500ng/mL)阿霉素的回收率分别为101.2%、95.1%和91.4%,检测血浆低、中、高三个浓度(8、50、500ng/mL)塞来昔布的回收率分别为105.6%、106.8%和93.7%.大鼠尾静脉注射5.8mg/kg阿霉素和3.8mg/kg塞来昔布的半衰期分别为2.3 h和3.6h,曲线下面积分别为670 ng·h·mL-1和1480ng·h·mL-1.结论:建立的方法灵敏、准确、快速,适甩于阿霉素和塞来昔布的药代动力学研究.     

不同放散试验对新生儿ABO溶血病的诊断价值对比

摘要 目的：分析与比较不同放散试验对新生儿ABO溶血病的诊断价值。方法：选择2017年9月至2019年6月在本院进行ABO溶血病检测的新生儿240例,取所有新生儿的静脉血样本2~3 mL,采用冷冻复融放散试验方法与改良热放散试验方法检测新生儿ABO溶血病的发生情况,并比较单独诊断和联合诊断的价值。结果：在240份标本中,冷冻复融放散试验检出新生儿ABO溶血病阳性130例,阳性检出率为54.2 %;改良热放散试验检出新生儿ABO溶血病阳性94例,阳性检出率为39.2 %;二者联合检出新生儿ABO溶血病阳性100例,阳性检出率为41.67 %,联合检出新生儿ABO溶血病阳性率和冷冻复融放散试验检出新生儿ABO溶血病阳性率显著高于改良热放散试验检出新生儿ABO溶血病阳性率(P<0.05)。临床最终诊断为新生儿ABO溶血病101例,阳性率为42.08 %,患儿ABO血型包括A型56例,B型45例。冷冻复融放散试验诊断新生儿ABO溶血病的敏感性和特异性为73.8 %和95.5 % ,ROC曲线面积0.775;改良热放散试验检诊断为新生儿ABO溶血病的敏感性和特异性为100 %和95.2 %,ROC曲线面积0.853;二者联合诊断对新生儿ABO溶血病的敏感性和特异性为90.0 %和97.85 %,ROC曲线面积0.872,联合诊断特异性优于改良热放散试验检诊和冷冻复融放散试验诊断,且改良热放散试验检诊敏感性优于冷冻复融放散试验诊断。结论：相对于冷冻复融放散试验,改良热放散试验对新生儿ABO溶血病的诊断敏感性更高,且不影响诊断特异性,两种放散方法联合检测具有更好的应用价值。     

基于不同浓度变量的温带落叶阔叶林CO2储存通量的误差分析

利用帽儿山温带落叶阔叶林通量塔8层CO₂/H₂O浓度廓线的测定数据,比较分析了基于不同浓度变量\[密度(ρ_c)、摩尔分数(c_c)和混合比(χ_c)\]计算CO₂储存通量(F_s)的误差.结果表明： 通量观测的控制体积内部干空气储存量不为常数,其波动可引起CO₂分子进出控制体积,即干空气储存通量调整项(F_sd)的变化.在夜间以及昼夜转换期,F_sd相对于涡动通量而言较大,忽略F_sd将为森林与大气之间净CO₂交换量的计算带来误差.大气水热过程对F_s计算引起的误差包括3方面：空气温度变化引起的误差最大,比大气压强(P)的影响高1个数量级;水蒸气的影响在温暖湿润的夏季大于P的影响,但在寒冷干燥的冬季则相反; P的效应在全年均较低.基于ρ_c、c_c和χ_c计算F_s分别平均高估CO₂有效储存通量(F_{s_E})8.5%、0.6%和0.1%.在通量计算过程中,建议选择对大气水热过程守恒的χ_c计算F_s.     

李氏香芋的组织培养

1植物名称李氏香芋(Colocasia lihengiae). 2材料类别块茎和直立根茎上的主芽和腋芽、试管苗叶、叶柄及根段. 3培养条件(1)丛芽诱导培养基:1/2MS 6-BA 5mg·L-1(单位下同) NAA0.5;(2)丛芽增殖培养基为1/2MS 6-BA 3 NAA 0.1;(3)生根培养基为1/2MS NAA 0.5 IBA 0.8 KT 0.1.培养基中蔗糖浓度为3%,琼脂浓度为0.6%,pH 5.8.培养温度为(27±2)℃,光照时间12 h·d-1.光照度为2 000 lx.     

非酒精性脂肪肝对卵巢癌患者中紫杉醇代谢的影响

本研究采用LC-MS/MS方法测定卵巢癌患者血浆中紫杉醇的浓度,以探究非酒精性脂肪肝对紫杉醇药物代谢的影响。表明紫杉醇在卵巢癌非酒精性脂肪肝患者中的清除速率为(31.28±3.90)L/h,而在脂肪肝卵巢癌患者则为(21.04±4.00)L/h,即非酒精性脂肪肝卵巢癌患者中紫杉醇的清除速率比脂肪肝卵巢癌患者明显提高。药代动力学分析显示紫杉醇在不同的患者体内最大血药浓度差异很大,这可能与给药方案及癌症患者的病况有关。本试验结果对化疗前非酒精性脂肪肝干预治疗具有一定的参考价值。     

黄花美冠兰的组织培养和快速繁殖

1植物名称黄花美冠兰(Eulophia flava). 2材料类别种子. 3培养条件(1)芽的萌发培养基:1/2MS 5%椰子乳(CM);(2)芽的增殖培养基:MS KT 2.0 mg·L-1(单位下同) NAA 0.1 5%CM;(3)生根培养基:1/2MS NAA 0.5.上述培养基中蔗糖浓度均为3%,琼脂浓度为0.6%,pH 5.8～6.0.培养温度为25～27℃,照光16 h·d-1,光照度为1 500～2 000 1x.     

海南粗榧的离体快速繁殖

1植物名称海南粗榧(Cephalotaxus hainanensisLi). 2材料类别茎段. 3培养条件基本培养基为MS.(1)启动培养基:1/2MS 5%椰子乳(CM);(2)芽的增殖培养基:MS 6-BA 2.0 mg·L-1(单位下同) NAA 0.1 5%CM 0.2%活性炭;(3)生根培养基:1/2MS IBA10.上述培养基中麦芽糖浓度均为3%,琼脂浓度为0.6%,pH 5.8～6.0.培养温度为25～27℃,光照时间16 h·d-1,光强为30～40μmol·m-2·s-1.     

基于多次重复液相质谱生物实验数据校准方法研究

在蛋白质组学中,进行液相质谱(LC-MS)实验谱数据处理,发现并分析生物标志物的复杂肽或蛋白质样本的差异是重点,而校准相同样本的多次重复实验中肽链产生的洗脱时间峰信号(LC峰)是进行量化、分析差异的关键。目前多个重复实验数据的校准通常是在重复的实验数据集中根据液相二级质谱(LC-MS/MS)实验标识LC峰的时间特征,然后使用翘曲函数对时间特征进行对齐。由于多重数据的洗脱时间误差产生是随机的,统一使用翘曲函数校准会产生较大误差。为了解决这个问题,本研究重点研究了多个重复实验数据中LC峰的时间校准算法。我们选取了两个重复实验数据,采用机器学习的思路,通过选用两个数据的LC-MS/MS中重复检测到的肽链数据作为可信数据,部分选为训练序列,部分作为测试序列,建立统计数学模型,提出了一种新的校准算法,并采用测试序列对该统计模型进行准确率测试,表明算法的准确性达到95%以上;然后,将该模型应用在两个实验数据的所有LC-MS/MS肽链检测值上,提高检测值在多个数据中的覆盖率,表明覆盖率可以到达85%以上。     

宽叶石竹的组织培养与快速繁殖

1植物名称宽叶石竹(Dianthus hoeltzeri). 2材料类别嫩茎及茎尖. 3培养条件以MS为基本培养基.(1)启动培养基:MS;(2)增殖培养基:MS 6-BA 2.0 mg·L-1(单位下同) NAA 0.2;(3)生根培养基:1/2MS IBA0.1 NAA 0.3.上述培养基蔗糖浓度为3.0%,琼脂浓度0.6%,pH 5.8.培养温度25℃左右,光照度2 000 lx,光照时间12 h·d-1.     

LC-MS/MS测定单抗药动学参数的样品前处理方法研究进展

随着生物技术药物研发的大力开展,单抗类药物的药动学评价越来越受到重视。对近年来应用LC-MS/MS检测单抗类药物药动 学特征的文献进行归纳,总结其样品前处理的不同方法及各自优缺点和适用范围,为单抗类药物LC-MS/MS检测方法的进一步研究提供 参考。     

基于不同浓度变量的温带落叶阔叶林CO2储存通量的误差分析

利用帽儿山温带落叶阔叶林通量塔8层CO2/H2O浓度廓线的测定数据,比较分析了基于不同浓度变量[密度(ρc)、摩尔分数(cc)和混合比(χc)]计算CO2储存通量(Fs)的误差.结果表明:通量观测的控制体积内部干空气储存量不为常数,其波动可引起CO2分子进出控制体积,即干空气储存通量调整项(Fsd)的变化.在夜间以及昼夜转换期,Fsd相对于涡动通量而言较大,忽略Fsd将为森林与大气之间净CO2交换量的计算带来误差.大气水热过程对Fs计算引起的误差包括3方面:空气温度变化引起的误差最大,比大气压强(P)的影响高1个数量级;水蒸气的影响在温暖湿润的夏季大于P的影响,但在寒冷干燥的冬季则相反;P的效应在全年均较低.基于ρc、cc和χc计算Fs分别平均高估CO2有效储存通量(Fs_E)8.5%、0.6%和0.1%.在通量计算过程中,建议选择对大气水热过程守恒的χc计算Fs.     

牛大力的组织培养和快速繁殖

1植物名称牛大力(Millettia speciosa Champ.),又名美丽崖豆藤、大力牛. 2材料类别成熟种子. 3培养条件基本培养基为MS.(1)种子萌发培养基:1/2MS;(2)芽的增殖与继代培养基:MS 6-BA 2.0 mg·L-1(单位下同) NAA 0.5;(3)生根培养基:1/2MS IBA 1.0.上述培养基中蔗糖浓度均为3%,琼脂浓度为0.6%,pH 5.8～6.0.培养温度为25～27℃,光照时间16 h·d-1,光强为30～40μmol·m-2·s-1.     

LC-MS/MS测定小鼠血浆中多靶点抗AD bis-MEP-乙二酰胺杂合物ZLA浓度及药动学研究

目的:建立检测小鼠血浆内新型多靶点抗阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)药物双美普他酚-乙二酰胺杂合物(ZLA)浓度的高效液相色谱-质谱联用法(LC-MS/MS),并研究其在小鼠体内的药代动力学。方法:样品经甲醇沉淀去蛋白,应用Waters Xbridge C18色谱柱(2.1×100 mm,3.5μm),以甲醇-水(含5 m M甲酸铵,p H 9.8)(85:15,v/v)为流动相,流速0.25 m L/min;采用电喷雾(ESI)离子源,选择正离子模式多反应监测,待测物分别为m/z 304.3→107.0(ZLA)和m/z 621.7→232.1(内标)。分别给予KM小鼠腹腔和尾静脉注射ZLA 5mg/kg,不同时间点采集血浆用于ZLA定量分析。结果:ZLA和内标保留时间分别为3.2 min和2.5 min。血浆中ZLA线性范围为1-1000 ng/m L。血浆中提取回收率超过91%,日内和日间精密度RSD均小于6%。药动学研究结果显示,腹腔注射时ZLA可快速分布到血浆中,在10.2 min达到峰值,且能达到良好的生物利用度(47.6%)。结论:本研究建立的ZLA血药浓度测定方法快速、灵敏,特异性好,并成功应用于小鼠血浆中ZLA的药代动力学研究。本研究资料将为ZLA在AD治疗中的进一步临床前评估提供依据。     

白皮松成熟胚的离体培养研究

以白皮松成熟胚为外植体诱导再生小植株.试验结果表明,成熟胚不定芽诱导以MS培养基最佳,附加0.294 mg/L的NAA和3.56 mg/L的6-BA时,诱导率接近100%;MS培养基附加NAA(0.05 mg/L)时,平均增殖系数可达6.3以上.不定芽增殖率最大值(10)出现在SH培养基上,此时NAA浓度为0.05 mg/L、6-BA浓度为4 mg/L.MS培养基中加入适量活性炭和GA3能促进不定芽生长,随着活性炭和GA3浓度的增加,有效嫩梢(≥2cm和≥4 cm)的比率显著增高;当活性炭和GA3浓度过高时(分别超过2.75 g/L和4.1 mg/L),不定芽的伸长与生长受到抑制.在离体培养条件下,以种胚为外植体获得了无根苗.