脱落酸抗体的抗独特型抗体的制备与鉴定

用ABA多克隆抗体(Ab_1)以金黄色葡萄球菌菌体(SPA)作为载体,免疫家兔,制备的抗独特型抗体(Ab_2)初步纯化后用ELISA试验鉴定其特异性的结果表明,该抗独特型抗体具有良好的特异性,能阻断ABA抗体对ABA的结合反应,并与ABA结合蛋白结合,暗示其有模拟抗原的作用。 Jerne的免疫网络学说认为,特异性抗体(Ab_1)可变区中的独特型决定簇(Id)可诱导抗独特型抗体(Ab_2)的产生,Ab_2中的一部分可以模拟抗原的作用。Sege和Peterson提出,     

水稻类受体激酶OsCR4的抗体制备及特异性检测

运用生物信息学的方法对水稻类受体激酶OsCR4的抗原性进行分析,选取胞外部分片段与GST融合,在细菌大规模诱导该融合蛋白,利用GST sepharose进行亲和层析纯化,所得蛋白使用SDS-PAGE结合KCl/DTT染色切胶的方法得到收集。以此融合蛋白作为抗原免疫新西兰兔,获得了1：512,000效价的多克隆抗体,该抗体可特异识别水稻叶片微粒体组分中的OsCR4蛋白。     

脱落酸及其类似物对玉米线粒体异柠檬酸脱氢酶活性的影响

用(+)ABA及其两种RCA系列类似物(RCA．7a,RCA．7b)处理从玉米黄化芽提取的离体线粒体,三者均能促进线粒体上异柠檬酸脱氢酶(ICDH)的活性,另外,(+)ABA、RCA．7A及RCA．7b分子都有一个环己烯酮环(cyclohexenonering),差别仅在侧链的不同,这提示,此环己烯酮环是ABA表现此种促进作用所必需的。(+)ABA处理离体线粒体之前,先经抗ABA结合蛋白的抗体(anti-ABBPPAbs)处理,则(+)ABA促进ICDH活性的效应被显著抑制。暗示,线粒体上可能存在具有受体功能的ABA结合位点。     

苹果果实细胞质中依赖活体组织的ABA高亲和力特异结合蛋白

将苹果（Malus pumila L.cv.Starkrimon)果肉微粒体和细胞可溶组分在含有^3H-ABA的缓冲介质中分别温育,仅在细胞可溶组分中测到微弱的^3H-ABA结合活性。但是,如何将果肉组织圆片在^3H-ABA缓冲介质中直接温育,经制备亚细胞组分后直接测定,在细胞可溶组分中测到很高的^3H-ABA特异结合活性。果肉圆片用沸水预先热处理使细胞可溶组分中的^3H-ABA结合活性完全丧失,说明ABA结合依赖于组织的活体状态。药理实验证明了ABA结合位点的蛋白质性质,同时证明该蛋白的活性中心具有－SH和丝氨酸基因。ABA结合蛋白对ABA的结合具有可饱和性、可逆性和高亲和力。Scatchard作图证明存在2种ABA结合蛋白,一种具有较高的亲和力,其解离常数（Kd)为2.9mmol/L,另一种亲和力相对较低,其Kd值为71.4nmol/L。用ABA结构相似物进行的竞争实验证明了ABA结合蛋白对配体结合的立体特异性。分析了ABA结合蛋白与ABA结合的时间曲线、pH和温度依赖性。本研究检测到的依赖活体组织的ABA结合蛋白可能是果实发育过程中介导ABA信号的受体。     

一种与核酸复合的脱落酸结合蛋白

用抗脱落酸 (Abscisicacid ,ABA)结合蛋白 (ABBP)血清作为探针筛选玉米cDNA表达文库 ,从 2 0 0 0 0 0个独立噬斑中 ,仅获得 1个编码多肽的cDNA克隆 ,它与动物的某些核酸结合蛋白基因的同源性高达 6 0 %～ 6 5 % .此外 ,获得 1 2 0个编码玉米 1 7SrRNA的cDNA克隆 .鉴于此 ,对经ABA亲和纯化所得的ABBP及其抗血清进行了复查 .发现rRNA伴随ABBP而存在 ;该抗血清除能识别ABBP外 ,还能识别rRNA ,推断某些ABBP具有与核糖核酸结合的性质 ,即能与rRNA形成复合物     

肾炎致病原重组受体相关蛋白的表达及纯化

用pGEX载体系统体外构建了Heymann肾炎致病原受体相关蛋白(RAP)重组表达质粒,经IPTG诱导,该质粒表达的融合蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达,其表达量达39．4％,经GST-Sephrose 4B亲和层析,得到了高度纯化,其诱导产生的抗体经蛋白质印迹法分析证明能识别肾皮质天然抗原44ku受体相关蛋白.RAP表达及纯化的成功为研究致病原病理性表型提供了有利条件．     

丙型肝炎病毒复合高变区1模拟表位蛋白的免疫原性分析

将丙型肝炎病毒高变区1(HVR1)模拟表位融合基因插入原核表达载体pGEX-4T-1,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,经亲和层析和凝胶过滤层析获得HCVHVR1模拟表位融合蛋白。用Westernblot和ELISA检测融合蛋白与HCV抗体阳性血清的结合情况。皮下注射免疫BALB/c小鼠,用ELISA检测小鼠血清中的抗HCV抗体水平及其与天然HCV高变区1合成肽的交叉反应。结果表明融合蛋白能与HCV抗体阳性血清特异结合,融合蛋白与HCV抗体阳性血清的结合频率为71.6%(25/35)。融合蛋白免疫小鼠后能有效诱导免疫应答,其诱生的特异性抗体最高滴度达104(免疫后第8周),且该抗体能同2条天然HCVHVR1合成肽发生交叉反应。本研究提示,HCV复合HVR1模拟表位融合蛋白在丙型肝炎疫苗的研发中可能具有潜在应用价值。     

脑型一氧化氮合成酶的钙调蛋白结合区的表达及活性鉴定

用PCR法克隆出nNOS的CaM结合区基因(nNOS 2455～2988bp),并在大肠杆菌中进行了高效表达。经金属离子螯合亲和层析得到纯度为90％以上的重组蛋白．分子量为22kDa,CaM Oveday assay证实该蛋白具有CaM的结合活性。由于所表达的重组蛋白既具有序列特异性又具有CaM的结合活性．因此。可将它作为筛选nNOS特异性抑制肽的靶蛋白,亦可用于特异性抗体的制备。     

小鼠Lewis肺癌组织中糖肽的分离纯化及其对肿瘤细胞与层粘连蛋白基质粘着的影响

小鼠Lewis肺癌组织经氯仿甲醇去除脂类,用木瓜蛋白酶消化,再经Sephadex柱层析分离得到总糖肽。它有明显地抑制小鼠Lewis肺癌细胞,S180肉瘤细胞及人巨细胞肺癌细胞与层粘连蛋白(Laminin,LN)基质粘着的作用;对层粘连蛋白受体(LN-R)与其配体的识别及结合也具有同样明显的阻断效应。糖肽的上述作用均具有剂量依赖性。进一步经ConA-Sepharose CL-4B亲和层析将总糖肽分为三个部分。与ConA不结合的糖肽部分对Lewis肺癌细胞与LN基质的粘着也具有剂量性抑制作用。     

盐胁迫对玉米根尖质膜上受钙激活的蛋白激酶的影响

以02mal／L的NaCl对玉米根尖进行盐胁迫,导致质膜上一种受钙激活的蛋白激酶（该激酶表现为钙依赖蛋白激酶的特性）的活性迅速增加。盐胁迫至15min时激酶的活性达到最大,较对照高30％,以后逐渐降低,盐胁迫至切50min时激酶活性仍略高于对照。10％PEG6000处理玉米很尖也可诱导质膜上受钙激活的蛋白激酶活性增加。用外源ABA处理玉米根尖,未导致上述蛋白激酶活性的变化。放射自显影显示质膜上33kD和58kD两种蛋白可能是质膜受钙激活的蛋白激酶的内源底物。     

丙型肝炎病毒复合高变区1模拟表位蛋白的免疫原性分析

将丙型肝炎病毒高变区1(HVR1)模拟表位融合基因插入原核表达载体pGEX-4T-1,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,经亲和层析和凝胶过滤层析获得HCV HVR1模拟表位融合蛋白.用Western blot和ELISA检测融合蛋白与HCV抗体阳性血清的结合情况.皮下注射免疫BALB/c小鼠,用ELISA检测小鼠血清中的抗HCV抗体水平及其与天然HCV高变区1合成肽的交叉反应.结果表明融合蛋白能与HCV抗体阳性血清特异结合,融合蛋白与HCV抗体阳性血清的结合频率为71.6%(25/35).融合蛋白免疫小鼠后能有效诱导免疫应答,其诱生的特异性抗体最高滴度达104(免疫后第8周),且该抗体能同2条天然HCV HVR1合成肽发生交叉反应.本研究提示,HCV复合HVR1模拟表位融合蛋白在丙型肝炎疫苗的研发中可能具有潜在应用价值.     

波形蛋白介导猪繁殖与呼吸综合征病毒感染Marc-145细胞作用的初步研究

为了研究波形蛋白在介导PRRSV感染过程中的作用,根据GenBank中已发表的波形蛋白序列,设计特异性引物,利用RT-PCR方法从Marc-145细胞中扩增目的基因,克隆入pET-28a,转化表达菌BL21(DE3)中进行诱导表达,用SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物,将表达产物纯化后免疫BALB/c小鼠制备血清,用病毒阻断实验验证PRRSV与波形蛋白及其抗体的关系。用ELISA方法确定了重组波形蛋白与PRRSV结构蛋白N蛋白和囊膜蛋白GP5蛋白之间的关系。结果表明,成功的从Marc-145细胞中扩增出全长的波形蛋白基因,将其克隆入pET-28a,诱导后得到高效表达,表达蛋白纯化后免疫小鼠抗体效价达到105,病毒阻断实验表明波形蛋白能部分阻断PRRSV感染,其抗血清能完全阻断PRRSV感染。ELISA结果表明波形蛋白能与N蛋白结合而不与GP5蛋白结合。此结果为PRRSV感染的细胞的受体机制增添了新的内容,为PRRSV感染过程中受体间的相互作用关系研究奠定基础。     

一氧化氮参与调节盐胁迫诱导的玉米幼苗脱落酸积累

以三叶一心期的玉米幼苗为实验材料,研究了盐胁迫下玉米幼苗根尖和叶片中一氧化氮（NO）和脱落酸（ABA）积累之间的关系。结果表明,盐胁迫下玉米幼苗NO和ABA的含量均增加,用NO供体硝普钠（Sodium nitroprusside,SNP）处理时,ABA含量亦增加,且累积的时间较盐胁迫下早。用NO合成的抑制剂L-NAME （Nω-nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride）和NaN,处理时,可减弱盐胁迫诱导的ABA含量的增加,用NO清除剂cPTIO处理时,这种盐胁迫诱导的ABA增加减少。推测盐胁迫下产生的NO参与调节ABA的积累及逆境下植物的防御反应。     

梯度离心法制备鸡肝微粒体方法的建立

目的：建立梯度离心法制备鸡肝微粒体的方法。方法：利用蔗糖密度梯度离心法制备鸡肝微粒体,经透射电镜和Western—blot检测肝微粒体纯度,BCA法检测总蛋白质含量,CO差示光谱法检测总CYP450含量。结果：电镜下,制备的肝微粒体可清楚见到大量膜囊泡状结构,其它污染细胞器成分较少见;制备的肝微粒体仅与GRtXM抗体特异性结合;肝微粒体总蛋白质含量与总CYP450含量分别为8．749mg／mL和0．763nmol／mg。结论：利用蔗糖梯度密度离心法制备得到高质量鸡肝微粒体蛋白,为鸡细胞色素P450的深入研究奠定了基础。     

具有谷胱甘肽过氧化物酶活性的含硒单链抗体酶制备

 利用RT PCR从分泌有谷胱甘肽结合部位的单克隆抗体杂交瘤细胞株 2F3中 ,扩增出单抗重链可变区和轻链可变区基因 .经DNA测序后 ,用Linker(Gly4 Ser1) 3 构建成单链抗体 (scFv)表达载体pTMF scFv ,将重组质粒pTMF scFv转化到大肠杆菌BL2 1(DE3) ,实现了单链抗体的高效表达 .表达的单链抗体占菌体总蛋白 2 5%～ 30 % .该重组蛋白以包涵体形式存在 ,分子量为 30kD .经过金属螯合亲和层析纯化、复性和凝胶过滤纯化 ,得到电泳均一的单链抗体 .再经化学诱变 ,得到含硒单链抗体酶 ,其谷胱甘肽过氧化物酶活性为 330 0U μmol.采用荧光滴定法测定了单链抗体对谷胱甘肽的结合常数     

SHN3多克隆抗体纯化与鉴定

目的:利用SHN3免疫特异肽段亲和层析纯化抗SHN3多克隆抗体。方法:将制备多克隆抗体SHN3免疫原片段(99bp)划分为4段互相重叠等长的基因片段(48bp),构建原核表达重组质粒并转化E.coil的BL21(DE3)菌株。IPGT诱导重组蛋白表达,Western blotting筛选并人工合成与抗体免疫结合特异性片段,亲和层析纯化抗体,Western blotting检测纯化结果。结果:成功地筛选到SHN3免疫原特异肽段part-3,以亲和层析的方式纯化多克隆抗体,纯化后免疫特异性提高。结论:亲和层析的方式纯化得到的SHN3多克隆抗体抗体,有效地提高免疫特异性,为后续SHN3蛋白功能研究和应用奠定了基础。     

肿瘤相关抗原基因HCA520重组蛋白的表达纯化及其肝癌患者血清中相应抗体的分析

HCA5 2 0是用SEREX(serologicalidentificationofrecombinantcDNAexpressingcloning)方法 ,即用肝癌病人血清从肝癌组织cDNA表达文库中筛选得到的肝癌相关性抗原编码基因 .利用RT PCR技术检测了HCA5 2 0mRNA在各种组织中的分布情况 ,构建了GST融合表达载体并且用亲和层析的方法纯化表达的融合蛋白 .最后用Western印迹检测了重组蛋白的免疫反应性 ,用斑点印迹检测了肝癌病人血清中HCA5 2 0的天然抗体的存在情况 .结果表明 ,HCA5 2 0在各种组织中呈丰度差异分布 ,构建好的pGEX 4T 3重组载体经IPTG诱导后高效表达GST HCA5 2 0融合蛋白 ,其分子量约 4 9kD .经GST Agarose亲和层析 ,重组蛋白得到高度纯化 .Western印迹证实 ,纯化蛋白为目的重组蛋白 ,重组蛋白具有与天然蛋白相同或相似的免疫反应性 .斑点印迹分析表明 ,2 0份肝癌病人血清中有 1份HCA5 2 0抗体阳性 ,而 4份正常人均为阴性 .HCA5 2 0的足量提供 ,可用以研究其在致癌中的作用 ,并可以免疫动物制备抗体 .它作为抗原 ,分析其抗体在不同肿瘤病人中的表达情况 ,评估其在临床肿瘤诊断中的作用     

棉蚜His-CYP6J1融合蛋白的分离纯化及多克隆抗体的制备

通过亲和层析法纯化棉蚜His-CYP6J1融合蛋白,制备及鉴定其多克隆抗体。采用镍离子金属螯合亲和层析柱分离纯化棉蚜His-CYP6J1融合蛋白,SDS-PAGE检测纯化产物。用纯化得到的His-CYP6J1融合蛋白免疫小鼠,制备抗棉蚜P450CYP6J1多克隆抗体;采用ELISA法检测抗体效价;免疫组化法检测抗血清特异性。结果表明,纯化的His-CYP6J1融合蛋白免疫小鼠后得到多抗血清,ELISA法检测抗血清效价达1∶200 000。免疫组化结果显示,此多克隆抗体能够与棉蚜P450 CYP6J1天然蛋白特异性结合,却在棉铃虫没有发现相应的结合反应。上述结果对研究棉蚜单一P450蛋白结构、功能及其在棉蚜抗药性形成过程的作用奠定基础。     

采用亲和层析结合制备凝胶电泳获得高纯度的重组抗原蛋白用于制备蛋白质芯片

为了得到制备抗原芯片所需的高纯度重组抗原蛋白,需要建立一套适合于多种重组抗原表达和纯化的技术路线．采用了亲和层析结合制备胶电泳的方法,对16种用于构建蛋白质芯片的食管癌相关抗原基因进行了克隆重组并在大肠杆菌中进行了表达．对高表达的重组蛋白首先制备包涵体,然后采用Ni-Sepharose亲和层析得到初步纯化的蛋白质,最后使用SDS-PAGE制备胶电泳作进一步纯化．经过透析复性后,用于制备蛋白质芯片．采用亲和层析纯化重组蛋白,得率为71% ,纯度约为70%;在SDS-PAGE制备胶进一步纯化后,得率为32%,纯度为95%,经过透析和复性后,最终得率为21%,纯度为95%．得到的重组蛋白RPS4在ELISA检测中可以和血清中识别RPS4 的自身抗体起反应,并且,采用精纯抗原制备的蛋白质芯片,在检测抗原与抗体这一对反应中也具有较高的敏感性和特异性,适合大规模血清抗体的检测．研究表明,采用亲和层析结合制备凝胶电泳纯化抗原蛋白,是一条简便快捷,适合需要量不大,但对纯度要求比较高的蛋白质芯片制备的技术路线．     

大肠杆菌合成的乙型肝炎病毒核心抗原的研究Ⅱ．HBcAg的提纯

本文报道HBcAg基因工程菌MM206株的粗提物通过DEAE柱后,基因表达产物HBcAg与核酸及大部分细菌蛋白分开后,再经凝胶过滤和亲和层析作进一步提纯。经DEAE层析和亲和层析获得的纯制品聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱显示一主带和两小带。从sepharose 4B柱和亲和层析柱洗出的HBcAg,ELIsA检测证明其比活性分别比粗制品高40倍和100倍,以纯制的HBcAg注射家兔,在6只接受免疫的动物中均产生有抗一HBc,能与从人肝提取的HBcAg产生特异的免疫反应,这表明大肠杆菌合成的HBcAg在动物体内具有生物学活性。